Jenis dan Rancangan Penelitian Alat atau Instrumen Penelitian Tata Cara Penelitian

22

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan penelitian acak lengkap pola searah.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

Variabel- variabel yang digunakan adalah sebagai berikut :

1. Variabel utama

a. Variabel bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah variasi dosis pemberian jangka panjang infusa kulit Persea americana Mill. pada tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida b. Variabel tergantung Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah aktivitas ALT-AST pada tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi hewan uji yaitu tikus jantan galur Wistar dengan berat badan 150-250 g dan umur 2-3 bulan, frekuensi pemberian infusa kulit Persea americana Mill. satu kali sehari selama enam hari berturut-turut dengan waktu pemberian yang sama. Cara pemberian senyawa pada tikus dilakukan secara peroral dan bahan uji yang digunakan berupa kulit Persea americana Mill. b. Variabel pengacau tak terkendali Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi patologis dari tikus jantan galur Wistar yang digunakan.

3. Definisi operasional

a. Infusa kulit Persea americana Mill. Konsentrasi infusa kulit Persea americana Mill. 100 diperoleh dengan cara menginfundasi 8 gram serbuk kering kulit Persea americana Mill. dalam 100,0 mL air pada suhu 90 o C selama 15 menit b. Efek hepatoprotektif. Didefinisikan sebagai kemampuan infusa kulit Persea americana Mill. pada dosis tertentu untuk menurunkan aktivitas ALT-AST pada serum tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida c. Pemberian jangka panjang. Pemberian infusa kulit Persea americana Mill. dilakukan satu kali sehari selama enam hari berturut-turut dengan waktu pemberian yang sama d. Dosis efektif. Dosis terkecil dari infusa kulit Persea americana Mill. yang dapat menurunkan aktivitas ALT-AST pada serum tikus jantan galur Wistar yang terinduksi karbon tetraklorida

C. Bahan Penelitian

1. Bahan utama

a. Hewan uji yang digunakan berupa tikus jantan galur Wistar dengan umur 2- 3 bulan dan berat badan 150-250 g yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Kulit Persea americana Mill. yang di peroleh dari depot es di Yogyakarta

2. Bahan kimia

a. Bahan hepatotoksin yang digunakan adalah karbon tetraklorida yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. b. Aquades sebagai pelarut yang digunakan untuk pembuatan sediaan uji infusa kulit Persea americana Mill. yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Organik Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. c. Aqua bidestilata yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta digunakan sebagai blanko pada pengujian aktivitas AST-ALT d. Kontrol negatif yang digunakan adalah olive oil Bertoli ® yang diperoleh dari Supermarket Mirota Kampus, Yogyakarta. e. Pelarut Hepatoksin yang digunakan adalah olive oil Bertoli ® f. Reagen ALT Reagen serum yang digunakan adalah reagen ALT Abbott. Komposisi dan Konsentrasi dari reagen ALT adalah sebagai berikut. Tabel I. Komposisi dan Konsentrasi reagen ALT Komposisi Konsentrasi R1 : β -NADH 0,16 mgmL Lactate dehydrogenase 2,57 UmL L-Alanine 392 mmolL R2 : α -Ketoglutaric acid 77 mmolL L-Alanine 1.000 mmolL g. Reagen AST Reagen serum yang digunakan adalah reagen ALT Abbott. Komposisi dan Konsentrasi dari reagen AST adalah sebagai berikut. Tabel II. Komposisi dan Konsentrasi reagen AST Komposisi Konsentrasi R1 : β -NADH 0,16 mgmL Malate Dehydrogenase 0,64 UmL Lactate dehydrogenase 0,64 UmL L-Aspartate 232 mmolL R2 : α -Ketoglutarate 51,3 mmolL L-Aspartate 100 mmolL

D. Alat atau Instrumen Penelitian

Alat-alat pembuat serbuk kering kulit Persea americana Mill. antara lain : oven, mesin penyerbuk, timbangan elektrik. Alat-alat infusa kulit Persea americana Mill. antara lain : panci enamel, heater, termometer, gelas ukur, stopwatch, timbangan elektrik, corong. Alat-alat uji hepatoprotektif anatar lain : Seperangkat alat gelas berupa Beaker glass , gelas ukur, tabung reaksi, labu ukur, pipet tetes, batang pengaduk Pyrex Iwaki Glass ® . Timbangan elektrik Mettler Toledo ® , sentrifuge Centurion Scientific ® , vortex Genie Wilten ® , spuit per oral dan syringe 3 cc Terumo ® , spuit intraperotonial dan syringe 1 cc Terumo ® , pipa kapiler, tabung Eppendorf , Microlab 200 Merck ® .

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi Persea americana Mill. Determinasi kulit Persea americana Mill. dilakukan dengan cara mencocokan ciri-ciri makroskopis kulit Persea americana Mill. yang berasal dari depot es di Yogyakarta dengan literatur yang diperoleh Agrilink, 2001. 2. Pengumpulan bahan Bahan uji yang akan digunakan adalah serbuk kulit Persea americana Mill. yang berwarna kuning kecoklatan. Pengumpulan kulit Persea americana Mill. dikumpulkan pada bulan Juni – Juli 2014. 3. Pembuatan serbuk kulit Persea americana Mill. Kulit Persea americana Mill. dibersihkan dari sisa-sisa daging buah yang menempel lalu di cuci hingga bersih. Setelah itu kulit di potong di robek kecil-kecil dan diangin-anginkan sehingga kulit tidak nampak terlalu basah lalu dioven pada suhu 50 o C selama 24 jam. Setelah kering, kulit dibuat serbuk dan diayak dengan ayakan no. 40 agar kandungan fitokimia yang terkandung dalam kulit Persea americana Mill. lebih mudah terekstrak karena luas permukaan serbuk dengan pelarut semakin besar. 4. Penetapan kadar air serbuk kulit Persea americana Mill. Proses penetapan kadar air serbuk kulit Persea americana Mill. dilakukan dengan menggunakan alat moisture balance . Serbuk ditimbang dan dicatat sebagai bobot sebelum dipanaskan. Lalu serbuk kulit Persea americana Mill. dipanaskan selama 15 menit pada suhu 105 ˚C. Kemudian serbuk ditimbang kembali sebagai bobot sesudah pemanasan. Selisih bobot sebelum pemanasan dan sesudah pemanasan merupakan kadar air dari sampel yang diteliti. 5. Pembuatan infusa kulit Persea americana Mill. Penelitian ini mengacu pada penelitian Putri 2013 mengenai Efek Hepatoprotektif Infusa biji Persea americana Mill. terhadap aktivitas ALT- AST serum pada tikus terinduksi karbon tetraklorida yang mana peneliti tersebut menggunakan 8 gram serbuk dan 116 mL. Dalam penelitian ini, infusa kulit Persea americana Mill dibuat dengan mengambil sebanyak 8 g serbuk kulit Persea americana Mill. dimasukkan ke dalam panci enamel lalu dibasahi terlebih dahulu dengan 16 mL aqudest lalu di tambahkan lagi dengan 100,0 mL aquadest. Campuran ini kemudian dipanaskan diatas heater pada suhu 90 o C selama 15 menit. Waktu 15 menit terhitung pada saat campuran mencapai suhu 90 o C. lalu menyiapkan corong yang telah diberi kain flannel. Kain flannel sebelum di tuang infusa kulit Persea americana Mill. terlebih dahulu dijenuhkan dengan aquades panas. Setelah itu hasil infusa disaring, diperas dan ditampung dalam labu ukur 100 mL, jika kurang tambahkan aquades panas melalui kain flannel hingga tanda batas. Infusa kulit Persea americana Mill. dibuat dengan konsentrasi 8. 6. Pembuatan larutan karbon tetraklorida dengan konsentrasi 50 Pembuatan larutan karbon tetraklorida konsentrasi 50 didasarkan pada penelitian Janakat dan Al-Merie 2002 yang mana perbandingan volume karbon tetraklorida dan olive oil sebagai pelarut adalah 1 : 1. Volume karbon tetraklorida dan olive oil dibuat sama pada saat akan dicampurkan. 7. Uji Pendahuluan a. Penetapan dosis hepatotoksik karbon tetraklorida Penetapan dosis hepatotoksik karbon tetraklorida didasarkan pda penelitian Janakat dan Al-Merie 2002 yang menjelaskan bahwa dosis karbon tetraklorida yang dapat menyebabkan terjadinya hepatotoksik adalah 2 mLkgBB. Dosis ini diketahui mampu merusak sel-sel hepar pada tikus jantan galur Wistar yang ditunjukkan melalui peningkatan aktivitas ALT-AST tetapi tidak menimbulkan kematian hewan uji. Menurut penelitian Cao, et.al ., 2014 aktivitas serum ALT-AST pada tikus yang terinduksi karbon tetraklorida akan meningkat 3 – 4 kali dari nilai normal. Penelitian Nurcahyanti 2013 menjelaskan peningkatan ALT-AST sebesar 3 – 5 kali dari kondisi awal mampu menyebabkan terjadinya kerusakan sel pada hati tikus. b. Penetapan dosis infusa kulit Persea americana Mill. Berdasarkan penelitian Putri 2013 konsentrasi infusa serbuk biji Persea americana Mill. yang digunakan sebesar 8g100mL yang mana akan dilanjutkan pada penelitian ini dengan membuat konsentrasi infusa kulit Persea americana Mill. sebesar 8. Peringkat dosis yang digunakan didasarkan pada pengobatan yang biasa digunakan pada masyarakat, yaitu sekitar ± 2 sendok makan atau setara dengan 4 gram serbuk kulit Persea americana Mill. yang direbus dengan 250 ml air. Maka dosis perlakuan yang digunakan adalah 4 g70 kgBB manusia. Konversi dosis tikus manusia 70 kg ke tikus 200g = 0,018. Dosis untuk 200 g tikus = 0,018 x 4g = 0,72 g200 g BB = 360 mgkg BB. Konsentrasi maksimal infusa kulit Persea americana Mill. yang dibuat adalah 8 g100 ml, dengan asumsi berat badan maksimal hewan uji adalah 250 g dan volume pemberian maksimal infusa secara p.o = 5 ml. Berdasarkan perhitungan : D x 250 g = 8 g 100ml x 5 ml D = 1600 mgkg BB, dosis ini merupakan dosis tinggi perlakuan. Untuk mendapatkan dosis tengah perlakuan, terlebih dahulu dihitung faktor kelipatan dari dosis rendah dan dosis tinggi yang sudah diperoleh. Perhitungan faktor kelipatan sebagai berikut : n = jumlah peringkat dosis yang digunakan. Penelitian ini menggunakan 3 peringkat dosis maka n = 3, sehingga perhitungannya sebagai berikut. = 2,1 Faktor Kelipatan Berdasarkan faktor kelipatan yang diperoleh maka dosis tengah dan dosis rendah perlakuan ditentukan sebagai berikut : D = 1600 mg kg BB : 2,1 = 761,9 mg kg BB dosis tengah D = 761,9 mg kg BB : 2,1 = 362,8 mg kg BB dosis rendah c. Penetapan waktu pencuplikan darah Pada penelitian Janakat dan Al-Merie 2002 dan Nurcahyanti 2013 menjelaskan bahwa waktu optimum kenaikan serum ALT-AST terjadi pada waktu 24 jam. Pada penelitian ini dilakukan orientasi dengan 3 cuplikan, yaitu jam 0, 24, dan 48 jam setelah pemejanan karbon tetraklorida. Hal ini dilakukan untuk melihat profil kenaikan serum ALT. Dalam orientasi menggunakan tiga kelompok perlakuan waktu dan disetiap kelompok menggunakan lima ekor tikus. Pengambilan darah dilakukan melalui sinus orbitalis mata. Lima ekor tikus ini diambil darahnya masing-masing pada jam ke 0, 24, dan 48 jam setelah pemejanan karbon tetrakorida untuk diukur aktivitas serum ALT. 8. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji Sejumlah tiga puluh ekor tikus dibagi secara acak ke dalam enam kelompok perlakuan yang masing-masing perlakuan sejumlah lima ekor tikus. Kelompok I kontrol hepatotoksin diberi campuran karbon tetraklorida dan olive oil sebagai pelarut dengan perbandingan 1 : 1 dengan dosis 2 mLkgBB secara intraperitonial . Kelompok II Kontrol negatif olive oil diberi olive oil sebanyak 2 mLkgBB secara intraperitonial . Kelompok III Kontrol Infusa diberi infusa kulit Persea americana Mill. dosis 1600 mgkg BB secara per oral selama 6 hari berturut-turut. Kelompok IV dosis 362,8 mgkg BB diberi infusa kulit Persea americana Mill. secara per oral. Kelompok V dosis 761,9 mgkg BB diberi infusa kulit Persea americana Mill. secara per oral. Kelompok VI dosis 1600 mgkg BB diberi infusa kulit Persea americana Mill. secara per oral. Semua perlakuan dilakukan sekali sehari selama enam hari berturut-turut. Pada hari ke tujuh kelompok perlakuan IV-VI diberi larutan karbon tetraklorida dosis 2 mLkg BB secara per oral. Dua puluh empat jam paska di induksi karbon tetraklorida tikus diambil darahnya melalui sinus orbitalis pada mata, dan diukur aktivitas ALT-AST pada serum. 9. Pembuatan serum Darah diambil melalui bagian sinus orbitalis mata tikus dan di tampung dalam tabung Eppendorf . Darah didiamkan selama kurang lebih 15 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit. Kemudian diambil bagian supernatannya serum. 10. Pengukuran aktivitas ALT serum pada orientasi Alat yang digunakan untuk mengukur aktivitas ALT serum adalah Microlab 200 Merck ® . Sebelum melakukan pengukuran sampel, alat di flushing dengan menggunakan aqua bidestilata selama ± 30 menit. Analisis fotometri ALT dilakukan dengan cara : 100 µl serum dicampur dengan 1000 µl reagen I lalu di vortex selama 5 detik, didiamkan selama 2 menit, setelah itu dicampur dengan 250 µl reagen II, kemudian di vortex selama 5 detik dan dibaca serapan setelah 1 menit. Aktivitas ALT serum dinyatakan dalam UL. Pengukuran aktivitas ALT serum saat orientasi dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dan pengukuran aktivitas ALT-AST serum saat penelitian dilakukan di Laboratorium Parahita Yogyakarta.

F. Tata Cara Analisis Hasil