19
BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian ini dilakukan secara eksperimental. Penelitian meliputi pengumpulan dan pengolahan bahan tumbuhan, identifikasi bahan tumbuhan,
karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak n-heksan, analisis ekstrak n-heksan dengan Kromatografi Lapis Tipis, Kromatografi Kolom, uji
kemurnian dengan KLT dua arah dan identifikasi isolat secara Spektrofotometri UV dan Spektrofotometri IR. Penelitian dilakukan di Laboratorium Fitokimia dan
Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari alat-alat gelas laboratorium, blender Phillips, desikator, krus porselin, lemari pengering,
mikroskop Olympus, neraca analitik Vibra Aj, oven Fisher Scientific, seperangkat alat perkolasi, seperangkat alat kromatografi kolom, hair dryer
Maspion, botol penyemprot, seperangkat alat penetapan kadar air, spektrofotometer UV Shimadzu, spektrofotometri IR IR-Prestige 21.
3.2 Bahan
Bahan yang digunakan adalah talus rumput laut Turbinaria ornata Turner J. Agardh. Bahan-bahan kimia berkualitas pro analisis E-Merck yaitu:
amil alkohol, asam asetat anhidrida, asam klorida pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi III klorida, bismuth III nitrat, isopropanol,
kloroform, metanol, n-heksan, natrium hidroksida, raksa II klorida, serbuk magnesium Mg, timbal II asetat, kristal kloralhidrat, toluen, kalium iodida,
20 α-naftol, plat lapis silika gel GF
254
, silika gel 60 H. Bahan kimia berkualitas teknis: etanol 96 dan air suling.
3.3 Pembuatan Pereaksi
Prosedur pembuatan pereaksi berdasarkan referensi dari Materia Medika Indonesia Jilid VI 1995.
3.3.1 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya, lalu ditambahkan 2 g iodium kemudian ditambahkan air suling
hingga diperoleh larutan 100 ml.
3.3.2 Pereaksi Dragendorff
Larutan bismut nitrat P 40 bv dalam asam nitrat P sebanyak 20 ml dicampur dengan 50 ml kalium iodida P 54,4 bv, didiamkan sampai memisah
sempurna, lalu diambil lapisan jernih dan diencerkan dengan air secukupnya hingga 100 ml.
3.3.3 Pereaksi Mayer
Larutan raksa II klorida P 2,266 bv sebanyak 60 ml dicampur dengan 10 ml larutan kalium iodida P 50 bv, kemudian ditambahkan air secukupnya
hingga 100 ml.
3.3.4 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N
hingga diperoleh larutan 100 ml. 3.3.5
Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml.
21
3.3.6 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida sebanyak 100 ml.
3.3.7 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 ml larutan asam klorida pekat ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml.
3.3.8 Pereaksi asam sulfat 2 N
Sebanyak 9,8 ml larutan asam sulfat pekat ditambahkan air suling sampai 100 ml.
3.3.9 Pereaksi kloralhidrat
Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling.
3.3.10 Pereaksi penyemprot Liebermann-Burchard
Sebanyak 5 ml asam sulfat pekat dicampurkan dengan 50 ml etanol 96, kemudian ditambahkan dengan hati-hati 5 ml asam asetat anhidrida ke dalam
campuran tersebut dan dinginkan.
3.4 Pengambilan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan
3.4.1 Pengambilan bahan tumbuhan
Pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan bahan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan
tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rumput laut Turbinaria ornata Turner J. Agardh yang diperoleh dari pantai Lampuuk, Propinsi
Nanggroe Aceh Darussalam pada bulan Maret 2014.
22
3.4.2 Identifikasi bahan tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Identifikasi bahan tumbuhan dilakukan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Pusat Penelitian Oseanografi, Jakarta.
3.4.3 Pengolahan bahan tumbuhan
Bahan tumbuhan yang digunakan adalah talus rumput laut Turbinaria ornata Turner J. Agardh. Rumput laut dibersihkan dari kotoran-kotoran yang
melekat seperti pasir dan sisa-sisa karang, dicuci dengan air mengalir, ditiriskan kemudian ditimbang sebagai berat basah, selanjutnya dikeringkan dalam lemari
pengering pada temperatur ± 40°C sampai kering ditandai bila diremas rapuh, kemudian ditimbang sebagai berat kering. Simplisia yang telah kering dihaluskan
dengan menggunakan blender sampai menjadi serbuk lalu disimpan pada suhu
kamar.
3.5
Pemeriksaan Karakteristik 3.5.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, tekstur dan ukuran serta pemeriksaan organoleptik dengan mengamati warna, rasa dan
bau dari talus rumput laut Turbinaria ornata Turner J. Agardh.
3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia rumput laut Turbinaria ornata Turner J. Agardh. Serbuk ditaburkan di atas kaca objek yang
telah ditetesi kloralhidrat, ditutup dengan kaca penutup kemudian diamati di bawah mikroskop.
3.5.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen.
23
a. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2
jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml.
b. Penetapan kadar air simplisia
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama dimasukkan ke dalam labu berisi toluen yang telah dijenuhkan, kemudian labu dipanaskan
hati-hati selama 15 menit, setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes per detik sampai sebagian besar air terdestilasi. Kecepatan destilasi
dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik, setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian
tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar, setelah air dan toluen memisah sempurna, lalu volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih
kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1998.
3.5.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu
bersumbat, dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering
dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105ºC sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang
larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, 1995.
24
3.5.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 di dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam
pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, setelah itu disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara sampai kering. Sisa yang diperoleh dipanaskan pada suhu 105ºC sampai bobot tetap. Kadar dalam
persen sari yang larut dalam etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, 1995.
3.5.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 gserbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan kedalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada suhu 600ºC selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh
bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, 1995.
3.5.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total dididihkan dalam asam klorida encer sebanyak 25 ml selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam
asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, dicuci dengan air panas, lalu dipijar sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang.
Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, 1995.
25
3.6 Skrining Fitokimia
3.6.1 Pemeriksaan alkaloid
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2
menit, didinginkan lalu disaring. Filtrat dipakai untuk tes alkaloid. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalam masing-masing tabung reaksi dimasukkan 0,5 ml
filtrat. Pada tabung I
: ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer, terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning.
Pada tabung II : ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff, terbentuk endapan
berwarna coklat atau jingga kecoklatan. Pada tabung III
: ditambahkan 2 tetes pereaksi Bourchardat, terbentuk endapan berwarna coklat sampai kehitaman.
Alkaloid disebut positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua atau tiga dari percobaan di atas Depkes, 1995.
3.6.2 Pemeriksaan flavonoid
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 10 g, ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml
filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna
merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.6.3 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran dari 7 bagian etanol 96 dengan 3 bagian air suling 7:3 dan 10 ml
26 asam klorida 2 N, kemudian direfluks selama 10 menit, didinginkan, lalu disaring.
Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran
isopropanol dan kloroform 2:3, perlakuan ini diulangi sebanyak 3 kali. Sari organik dikumpulkan dan ditambahkan Na
2
SO
4
anhidrat, disaring, kemudian diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50ºC, sisanya dilarutkan dalam 2 ml
metanol. Sari air digunakan untuk percobaan berikut, 0,1 larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian diuapkan di atas penangas air. Pada
sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes larutan pereaksi Molish, lalu ditambahkan dengan perlahan-lahan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuk
cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya ikatan gula glikon atau glikosida Depkes, 1995.
3.6.4 Pemeriksaan saponin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok
kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes
asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes, 1995.
3.6.5 Pemeriksaan tanin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g, disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan
diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Warna biru atau hijau kehitaman yang terjadi pada larutan menunjukkan adanya
senyawa tanin Farnsworth, 1966.
27
3.6.6 Pemeriksaan steroidtriterpenoid
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan
beberapa tetes pereaksi Liebermann-Burchard. Warna biru atau biru kehijauan yang terjadi menunjukkan adanya steroid, sedangkan warna merah, merah muda
atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid Harborne, 1987.
3.7 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak n-heksan rumput laut Turbinaria ornata Turner J. Agardh dilakukan dengan cara perkolasi. Prosedur pembuatan ekstrak secara
perkolasi, yaitu sebanyak 500 g serbuk simplisia dibasahi dengan n-heksan dan dibiarkan selama 3 jam kemudian dimasukkan ke dalam alat perkolator, lalu
dituang cairan penyari n-heksan sampai semua simplisia terendam dan terdapat selapis cairan penyari diatasnya, mulut tabung perkolator ditutup dengan
alumunium foil dan dibiarkan selama 24 jam, kemudian kran dibuka dan dibiarkan tetesan ekstrak mengalir dengan kecepatan 1 ml per menit, perkolat
ditampung. Cairan penyari ditambahkan berulang-ulang secukupnya sehingga selalu terdapat cairan penyari di atas simplisia. Perkolasi dihentikan setelah
tetesan perkolat terakhir tidak bereaksi lagi dengan pereaksi Liebermann- Bouchard. Ekstrak lalu dipekatkan dengan alat penguap vakum putar hingga
diperoleh ekstrak kental Depkes, 1979.
3.8 Analisis Ekstrak n-heksan secara Kromatografi Lapis Tipis KLT
Kategori