Identifikasi Flavonoid
: Ekstrak ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada lempeng KLT. Fase diam yang digunakan adalah selulosa, fase gerak n-butanol :
asam asetat : air 4:1:5 vv, dan pembanding rutin. Langkah selanjutnya adalah pengeluasian lempeng dengan jarak rambat 10 cm. Pengamatan dilakukan di
bawah sinar UV 254 nm dan UV 365 nm dan dideteksi dengan pereaksi Alumunium III Klorida. Harga Rf dan warna bercak uji dibandingkan dengan
harga Rf dan warna pembanding. Pembuatan standar rutin : 10 mg rutin dilarutkan dalam 10 ml metanol.
5. Uji anti fungi
a. Sterilisasi alat-alat dan bahan
Alat-alat seperti cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, pipet volume, ujung mikropipet dan media SDA yang akan digunakan untuk pemeriksaan
aktivitas antifungi disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 ˚C dengan tekanan 1
atm selama 15 menit.
b. Pembuatan larutan uji
Konsentrasi ekstrak etanol
Berat ekstrak etanol g Pelarut Tween 80 ml
60 1,2 2 50 1,0 2
40 0,8 2 30 0,6 2
20 0,4 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Sebagai kontrol positif digunakan Ketokonazol yang dibuat dengan melarutkan 0,1 mg serbuk Ketokonazol dalam 100 ml metil alkohol dan kontrol negatif
Tween 80.
c. Pembuatan media SDA
Sebanyak 65 gram SDA dimasukkan ke dalam Erlenmeyer, ditambahkan dengan 1 Liter aquadestilata. Kemudian ditutup dengan menggunakan kapas, dan
dimasukkan ke dalam autoklaf untuk disterilkan pada suhu 121 ˚C selama 15
menit dengan tekanan 1 atm.
d. Penyiapan stok
Candida albicans
Media SDA yang sudah steril dicairkan kemudian dituang ke dalam tabung reaksi dan dimiringkan, biarkan hingga membeku. Setelah membeku
diambil 1 ose fungi dari pertumbuhan dan diinokulasikan secara streak plate. Inkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37
°C. Digunakan sebagai stok.
e. Pengujian potensi anti fungi
Metode Difusi : Pengujian potensi antifungi ekstrak etanol daun sirih
merah dilakukan dengan metode difusi secara paper disk. Satu koloni fungi Candida albicans dari stok disuspensikan ke dalam media SDA cair,
diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 24 jam. Hasil suspensi dibandingkan
dengan standar Mc. Farland II 6.10
8
CFUml hingga kekeruhannya sama. Dari suspensi tersebut, diambil 0,1 ml kemudian ditambahkan ke dalam 20 ml media
SDA yang telah memadat dengan cara spread plate, kemudian didiamkan selama
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15 menit. Setelah itu, diletakkan paper disk 6 mm pada jarak tertentu diatas cawan petri.
Langkah yang terakhir, hasil pengenceran dari ekstrak etanol daun sirih merah dan kontrol diteteskan diatas paper disk sebanyak 10
µl. Sebagai kontrol positif digunakan Ketokonazol dan kontrol negatif digunakan Tween 80, lalu
diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 ˚C. Diukur diameter zona hambatnya
dengan menggunakan penggaris. Pengulangan pengukuran masing-masing diameter sebanyak 5 kali.
Metode Dilusi Padat : Di ambil 1 ose fungi dari stok fungi, kemudian
disuspensikan ke dalam 5 ml SDA cair campur rata dan inkubasi pada suhu 37 ˚C
selama 24 jam. Hasil suspensi dibandingkan dengan standar Mc. Farland II 6.10
8
CFUml hingga kekeruhannya sama lalu diambil 0,5 ml. Kemudian 0,5 ml ekstrak etanol daun sirih merah dengan kadar tertentu ditambahkan dalam
suspensi tadi dan dicampur rata dengan 15 ml SDA yang cairkan. Setelah divortex lalu dituang dalam cawan petri steril secara pour plate dan dibiarkan memadat
lalu diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 ˚C. Setelah masa inkubasi,
kekeruhan yang menunjukkan pertumbuhan Candida albicans dalam media diamati dan diberi penilaian menggunakan notasi + untuk media yang tampak
keruh. Hal ini berlaku untuk tiap ekstrak etanol daun sirih merah, kontrol negatif Tween 80 dan kontrol positif Ketokonazol. Hasil pengamatan dianalisis untuk
mendapatkan Konsentrasi Hambat Minimum KHM senyawa uji. Setelah ditemukan Konsentrasi Hambat Minimum KHM, kemudian dilakukan streak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
plate. Kadar Bunuh Minimum KBM ditentukan apabila sudah tidak ada pertumbuhan fungi uji.
G. Tata cara analisa data
Penentuan potensi antifungi dengan metode difusi agar ditunjukkan dengan adanya zona hambat di sekitar paper disk. Replikasi perlakuan masing-
masing dilakukan sebanyak 5 kali. Hasil pengukuran diameter zona hambat yang terbentuk dilakukan uji Kolmogorov Smirnov untuk mengetahui data terdistribusi
normal atau tidak. Kemudian diameter zona hambat yang terbentuk dari masing- masing konsentrasi dianalisis dengan ANOVA satu arah, dilanjutkan dengan uji
LSD dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan khasiat antar konsentrasi. Sedangkan pada metode dilusi padat, dengan membandingkan
kekeruhan dengan kontrol pertumbuhan dan kontrol negatif akan diperoleh Konsentrasi Hambat Minimum KHM dan Konsentrasi Bunuh Minimum KBM.
Analisis hasil KLT dilakukan dengan menghitung harga Rf dari bercak yang timbul dan mengamati warna bercak tersebut. Nilai Rf dan warna bercak
sampel dibandingkan dengan Rf dan warna bercak pembanding.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
