C. Definisi Operasional
1. Ekstrak etanol daun sirih merah adalah ekstrak yang diperoleh dengan cara
mengekstraksi 50 gram serbuk daun sirih merah menggunakan larutan penyari etanol 96 sebanyak 300 ml secara soxhletasi, penyarian dihentikan apabila
cairan penyari yang keluar dari soxhlet menjadi bening. 2.
Daya antifungi adalah kemampuan ekstrak etanol daun sirih merah untuk menghambat pertumbuhan Candida albicans.
3. Candida albicans adalah fungi uji gram positif yang berbentuk bulat lonjong,
bertunas menyerupai hifa pseudohifa diperoleh dari Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta.
4. Zona hambat adalah zona jernih yang sama sekali tidak dijumpai pertumbuhan
Candida albicans atau zona yang masih memperlihatkan pertumbuhan Candida albicans dalam jumlah sedikit di sekitar paper disk.
5. KHM Konsentrasi Hambat Minimum adalah konsentrasi minimal ekstrak
etanol daun sirih merah yang dapat menghambat pertumbuhan Candida albicans.
6. KBM Konsentrasi Bunuh Minimal adalah konsentrasi minimal ekstrak
etanol daun sirih merah yang dapat membunuh Candida albicans.
D. Bahan
Daun sirih merah yang diperoleh dari daerah Condong Catur, Sleman Yogyakarta; Kultur murni Candida albicans ATCC 10231 yang diperoleh dari
Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta; Medium SDA Sabouroud Dextrose
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Agar sebagai medium pertumbuhan; Etanol 96 sebagai penyari yang digunakan untuk mengekstraksi daun sirih merah, Tween 80 konsentrasi 5
sebagai larutan kontrol negatif, Ketokonazol sebagai kontrol positif, Aquadest steril, fase diam = selulosa, silika gel GF 254, fase gerak = n-butanol : asam asetat
: air 4:1:5 vv, t-butanol : kloroform : dietil amina 2:7:1vv, toluene : etil asetat 93:7 vv dan pembanding : rutin, skopolamin, eugenol, pereaksi semprot =
Alumunium III Klorida, Dragendorff, vanilin-asam sulfat, larutan standar Mc Farland II 6.10
8
CFUml.
E. Alat
Soxhlet pyrex, inkubator Memmert, type BE 40, GmbH+Co KG- D91126, Mycrobiologycal Safety Cabinet MSC, Vacum Rotary Evaporator
Janke Kunkel, Ika-labotechnik, RV05-ST, autoklaf Metode KT-40, ALP co, Ltd, Hamurashi, Tokyo, Japan, lampu UV 254 nm dan UV 365 nm, oven
Memmert, Germany, penyerbuk Retsch bv, Electric Sieve Shaker IML Indotest Multi LAB, Laminar Air Flow Inches W.C., Lemari pendingin
Sharp, Glass beaker pyrex, cawan petri, tabung reaksi pyrex, Erlenmeyer pyrex, pipet volume pyrex, batang pengaduk, gelas ukur pyrex, jarum ose,
paper disk, Mikropipet Ependrof-Netler-Hinz, kertas saring, alumunium foil, kertas sampul, kompor listrik, penggaris, lampu Bunsen, plat KLT, penyemprot
reagen tampak, bejana, neraca analitik Mettler PC 2000.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
F. Tatacara penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi dilakukan oleh Laboratorium Farmakognosi, Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. Determinasi dilakukan
dengan cara mencocokkan tanaman segar sirih merah dengan pustaka Backer and Bakhuizen van den Brink, 1965.
2. Pengumpulan bahan
Daun sirih merah diambil dari tanaman sirih merah di daerah Condong Catur, Sleman Yogyakarta. Daun dicuci dengan air mengalir untuk
menghilangkan kotoran yang melekat, lalu ditiriskan sampai sisa air menghilang. Daun dikeringkan dalam oven dengan suhu 45
˚C selama 48 jam. Setelah kering, lalu diserbuk dengan blender sampai halus dan diayak menggunakan ayakan
Aperture ukuran 250 mikrometer.
3. Ekstraksi
Sebanyak 50 gram serbuk kering daun sirih merah ditimbang, dibungkus dalam thimble dan dimasukkan ke dalam tabung soxhlet. Untuk penyarian
digunakan etanol 96 sebanyak 300 ml dan pengisiannya dengan tiga kali sirkulasi. Soxhletasi dihentikan bila tetesan terakhir dalam alat soxhlet sudah
bening. Ekstrak yang diperoleh kemudian diuapkan dengan Vacum Rotary Evaporator sampai didapatkan ekstrak kental dan ekstrak kental disimpan
didalam lemari es.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4. Identifikasi Kualitatif Kandungan Kimia Ekstrak Etanol Daun Sirih
Merah dengan Metode Uji Tabung dan Kromatografi Lapis Tipis KLT a.
Metode Uji Tabung Uji Alkaloid
: Ekstrak 0,5 g dipanaskan dalam tabung reaksi besar dengan asam klorida 1 2,5 ml selama 30 menit dalam penangas air mendidih. Suspensi
disaring dengan kapas ke dalam tabung reaksi. Larutan dibagi dua sama banyak, lalu ke dalam larutan tabung-1 ditambah dengan reaksi Dragendorff 3 tetes dan
larutan tabung-2 ditambah pereaksi Mayer 3 tetes. Terbentuknya endapan dengan kedua pereaksi tersebut menunjukkan adanya alkaloid.
Uji Minyak Atsiri : Sebanyak 0,5 g ekstrak ditambahkan 1 ml eter kocok, saring.
Filtrat dikering uapkan. Bila sedikit berbau aromatik, larutan residu dengan 3 tetes etanol, uapkan lagi sampai kering. Bila terjadi bau aromatik spesifik,
menunjukkan adanya minyak atsiri.
Uji Flavonoid : Ekstrak 0,5 g ditambahkan air 2,5 ml, dipanaskan selama 10
menit di atas air mendidih. Larutan disaring melalui kapas. Larutan ditambahkan dengan Besi III Klorida 3 tetes, larutan berwarna hijau sampai biru
menunjukkan adanya senyawa flavonoid.
Uji Tanin : Ekstrak etanol 0,5 g dipanaskan dengan air 2,5 ml selama 30 menit
diatas tangas air. Disaring, filtrat 5 ml ditambah larutan natrium klorida 2 1 ml, bila terjadi suspensi atau endapan disaring melalui kertas saring, kemudian
filtrat ditambah larutan gelatin 1 5 ml. Terbentuknya endapan menunjukkan adanya tanin.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
b. Metode Kromatografi Lapis Tipis
Ekstrak etanol daun sirih merah yang digunakan untuk identifikasi Kromatografi Lapis Tipis KLT dibuat dengan melarutkan 0,5 gram ekstrak
etanol daun sirih merah dengan Tween 80 konsentrasi 5 sebanyak 2 ml.
Identifikasi Alkaloid : Ekstrak ditotolkan pada fase diam silika gel GF 254 nm
dengan menggunakan pipa kapiler pada lempeng KLT. Fase gerak tertier butanol : kloroform : dietil amina 2:7:1 vv, dan pembanding skopolamin. Senyawa
dieluasikan sampai batas yang ditentukan yaitu 10 cm. Pengamatan dilakukan di bawah sinar UV 254 nm dan UV 365 nm dan dideteksi dengan pereaksi semprot
Dragendorff. Harga Rf dan warna bercak uji dibandingkan dengan harga Rf dan warna pembanding.
Pembuatan standar skopolamin : 5 mg skopolamin dilarutkan dalam 10 ml metanol.
Identifikasi Minyak Atsiri : Ekstrak ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada
lempeng KLT. Fase diam yang digunakan silika Gel GF 254 nm dan fase gerak yang digunakan toluena : etil asetat 93:7 vv. Sebagai pembanding digunakan
eugenol. Senyawa dieluasi hingga batas tertentu 10 cm kemudian dikeringkan. Selanjutnya dilihat pada UV 254 nm dan UV 365 nm. Pereaksi semprot yang
digunakan yaitu vanilin-asam sulfat. Harga Rf dan warna bercak uji dibandingkan dengan harga Rf dan warna pembanding. Harga Rf dan warna bercak uji
dibandingkan dengan harga Rf dan warna pembanding. Pembuatan standar eugenol : 10 ml eugenol dilarutkan dalam 10 ml toluen.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Identifikasi Flavonoid
: Ekstrak ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada lempeng KLT. Fase diam yang digunakan adalah selulosa, fase gerak n-butanol :
asam asetat : air 4:1:5 vv, dan pembanding rutin. Langkah selanjutnya adalah pengeluasian lempeng dengan jarak rambat 10 cm. Pengamatan dilakukan di
bawah sinar UV 254 nm dan UV 365 nm dan dideteksi dengan pereaksi Alumunium III Klorida. Harga Rf dan warna bercak uji dibandingkan dengan
harga Rf dan warna pembanding. Pembuatan standar rutin : 10 mg rutin dilarutkan dalam 10 ml metanol.
5. Uji anti fungi
a. Sterilisasi alat-alat dan bahan
Alat-alat seperti cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, pipet volume, ujung mikropipet dan media SDA yang akan digunakan untuk pemeriksaan
aktivitas antifungi disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 ˚C dengan tekanan 1
atm selama 15 menit.
b. Pembuatan larutan uji
Konsentrasi ekstrak etanol
Berat ekstrak etanol g Pelarut Tween 80 ml
60 1,2 2 50 1,0 2
40 0,8 2 30 0,6 2
20 0,4 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Sebagai kontrol positif digunakan Ketokonazol yang dibuat dengan melarutkan 0,1 mg serbuk Ketokonazol dalam 100 ml metil alkohol dan kontrol negatif
Tween 80.
c. Pembuatan media SDA
Sebanyak 65 gram SDA dimasukkan ke dalam Erlenmeyer, ditambahkan dengan 1 Liter aquadestilata. Kemudian ditutup dengan menggunakan kapas, dan
dimasukkan ke dalam autoklaf untuk disterilkan pada suhu 121 ˚C selama 15
menit dengan tekanan 1 atm.
d. Penyiapan stok
Candida albicans
Media SDA yang sudah steril dicairkan kemudian dituang ke dalam tabung reaksi dan dimiringkan, biarkan hingga membeku. Setelah membeku
diambil 1 ose fungi dari pertumbuhan dan diinokulasikan secara streak plate. Inkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37
°C. Digunakan sebagai stok.
e. Pengujian potensi anti fungi
Metode Difusi : Pengujian potensi antifungi ekstrak etanol daun sirih
merah dilakukan dengan metode difusi secara paper disk. Satu koloni fungi Candida albicans dari stok disuspensikan ke dalam media SDA cair,
diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 24 jam. Hasil suspensi dibandingkan
dengan standar Mc. Farland II 6.10
8
CFUml hingga kekeruhannya sama. Dari suspensi tersebut, diambil 0,1 ml kemudian ditambahkan ke dalam 20 ml media
SDA yang telah memadat dengan cara spread plate, kemudian didiamkan selama
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15 menit. Setelah itu, diletakkan paper disk 6 mm pada jarak tertentu diatas cawan petri.
Langkah yang terakhir, hasil pengenceran dari ekstrak etanol daun sirih merah dan kontrol diteteskan diatas paper disk sebanyak 10
µl. Sebagai kontrol positif digunakan Ketokonazol dan kontrol negatif digunakan Tween 80, lalu
diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 ˚C. Diukur diameter zona hambatnya
dengan menggunakan penggaris. Pengulangan pengukuran masing-masing diameter sebanyak 5 kali.
Metode Dilusi Padat : Di ambil 1 ose fungi dari stok fungi, kemudian
disuspensikan ke dalam 5 ml SDA cair campur rata dan inkubasi pada suhu 37 ˚C
selama 24 jam. Hasil suspensi dibandingkan dengan standar Mc. Farland II 6.10
8
CFUml hingga kekeruhannya sama lalu diambil 0,5 ml. Kemudian 0,5 ml ekstrak etanol daun sirih merah dengan kadar tertentu ditambahkan dalam
suspensi tadi dan dicampur rata dengan 15 ml SDA yang cairkan. Setelah divortex lalu dituang dalam cawan petri steril secara pour plate dan dibiarkan memadat
lalu diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 ˚C. Setelah masa inkubasi,
kekeruhan yang menunjukkan pertumbuhan Candida albicans dalam media diamati dan diberi penilaian menggunakan notasi + untuk media yang tampak
keruh. Hal ini berlaku untuk tiap ekstrak etanol daun sirih merah, kontrol negatif Tween 80 dan kontrol positif Ketokonazol. Hasil pengamatan dianalisis untuk
mendapatkan Konsentrasi Hambat Minimum KHM senyawa uji. Setelah ditemukan Konsentrasi Hambat Minimum KHM, kemudian dilakukan streak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
plate. Kadar Bunuh Minimum KBM ditentukan apabila sudah tidak ada pertumbuhan fungi uji.
G. Tata cara analisa data
Penentuan potensi antifungi dengan metode difusi agar ditunjukkan dengan adanya zona hambat di sekitar paper disk. Replikasi perlakuan masing-
masing dilakukan sebanyak 5 kali. Hasil pengukuran diameter zona hambat yang terbentuk dilakukan uji Kolmogorov Smirnov untuk mengetahui data terdistribusi
normal atau tidak. Kemudian diameter zona hambat yang terbentuk dari masing- masing konsentrasi dianalisis dengan ANOVA satu arah, dilanjutkan dengan uji
LSD dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan khasiat antar konsentrasi. Sedangkan pada metode dilusi padat, dengan membandingkan
kekeruhan dengan kontrol pertumbuhan dan kontrol negatif akan diperoleh Konsentrasi Hambat Minimum KHM dan Konsentrasi Bunuh Minimum KBM.
Analisis hasil KLT dilakukan dengan menghitung harga Rf dari bercak yang timbul dan mengamati warna bercak tersebut. Nilai Rf dan warna bercak
sampel dibandingkan dengan Rf dan warna bercak pembanding.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman Sirih Merah
Penelitian ini diawali dengan melakukan determinasi tanaman yang akan digunakan. Tujuan dilakukan determinasi tanaman sirih merah ini supaya tanaman
yang digunakan sebagai bahan penelitian ini benar-benar tanaman sirih merah Piper crocatum Ruiz Pav. sehingga tidak terjadi kesalahan dalam
penggunaan. Determinasi tanaman sirih merah dilakukan oleh Laboratorium
Farmakognosi, Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada dengan mencocokkan contoh tanaman sirih merah dengan metode
identifikasi baku Backer and Bakhuizen van den Brink, 1965. Berdasarkan hasil determinasi Lampiran I dapat dipastikan bahwa
tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman sirih merah Piper crocatum Ruiz Pav.
B. Pengumpulan dan Pengeringan Bahan
Tanaman sirih merah yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari daerah Condongcatur, Sleman Yogyakarta. Tanaman sirih merah yang digunakan
adalah tanaman sirih merah dengan lokasi tumbuh yang sama agar diperoleh keseragaman bahan dan kandungan kimia. Bagian tanaman yang digunakan
adalah daunnya yang dikumpulkan pada bulan November 2007. Daun diambil pada keadaan segar dengan kondisi daun dipilih setelah bagian 3 atau 4 tangkai
31
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kategori