17
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Tempat Penelitian
Karakterisasi morfologi dan persilangan dilakukan di Pusat Konservasi Tumbuhan Kebon Raya LIPI Bogor, Analisis flow cytrometry,
Analisis molekuler dilakukan di Laboratorium Pusat Kajian Hortikultura dan Tropika IPB Bogor dan Laboratorium Genetika Pusat Penelitian
Biologi LIPI Bogor, Analisis Sitologi dilakukan di Laboratorium Sitologi Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor.
B. Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan April 2012 sampai Nopember 2014
C. Tatalaksana Penelitian
Tahap-tahap kegiatan penelitian meliputi lima kajian 1. Identifikasi keragaman anggrek Coelogyne spp berdasarkan karakter
morfologi. Penelitian dilakukan di Pusat Konservasi Tumbuhan Kebon Raya LIPI
Bogor Jawa Barat. Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian merupakan koleksi
tanaman di Pusat Konservasi Tumbuhan Kebon Raya LIPI Bogor meliputi 6 spesies anggrek dari genus Coelogyne spp yaitu C. pandurata, C.
massangeana, C. mayeriana, C. asperata, C. celebensis dan C. rumphii. Identifikasi karakter morfologi dilakukan secara deskriptif
berdasarkan pengamatan langsung dan pendokumentasian bagian-bagian tanaman anggrek Coelogyne spp, meliputi 45 karakter Gravendeel and
Voogel, 2000, terdapat pada lampiran 6. Analisis data dilakukan menggunakan skoring data morfologi dari
data deskriptif ke dalam suatu bentuk skor secara biner. Besarnya kemiripan genetik antar individu diperoleh dari analisis klaster atau
gerombol menggunakan program NTSYSpc versi 2.02i dengan metode perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
18
UPGMA Unweighted Pair Group Method of Arithmatic Average fungsi SimQual Rohlf, 1998.
Coelogyne pandurata Coelogyne massangeana
Kalimantan Timur Sumatra Barat
Coelogyne mayeriana Coelogyne asperata
Kalimantan Barat Kalimantan
Coelogyne celebensis Coelogyne rumphii
Sulawesi Selatan Sulawesi Selatan
Gambar 2. Bahan penelitian tanaman anggrek Coelogyne spp.
2. Identifikasi keragaman genetik anggrek Coelogyne spp berdasarkan penanda molekuler RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
Penelitian ini dilaksanakan di Pusat Kajian Hortikultura dan Tropika PKHT IPB Bogor dan Laboratorium Genetika Pusat Penelitian Biologi
LIPI Bogor. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi 6 spesies: Coelogyne pandurata, C. massangeana, C. mayeriana, C. asperata, C.
celebensis dan C. rumphii. perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
19
Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah: CTAB, H2O, HCl, NaCL, EDTA, PVPP, NaCl, merkaptoetanol, CIAA kloroform
isoamylalkohol, Na Asetat, primer, master mix untuk PCR, agarose, buffer TAE, dan buffer TE gel loading.
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi timbangan analitik, mesin centrifuge, vortex, inkubator, gene quant, asppirator, ,
mesin PCR, elektroforesis tank, cetakan agarose, biorad dan kamera digital. Tahapan penelitian meliputi ekstraksi DNA, uji kuantitas dan kualitas
DNA, reaksi amplifikasi, dan elektroforesis. DNA genom diekstraksi dari daun muda menurut metode CTAB
Doyle dan Doyle, 1987, dengan beberapa modifikasi. Uji kualitas DNA, membuat elektroforesis agarosa dan dimasukkan ke dalam cetakan yang
mengandung TAE penyangga. Mempersiapkan DNA lambda sebagai pembanding. Pencampuran setiap sampel DNA dengan pewarna pemuatan
sebagai pemberat. Seleksi primer Operon Technology Operon Almaeda, 2000
digunakan untuk mendapatkan produk amplifikasi dengan tingkat polimorfisme yang tinggi. Primer yang digunakan adalah 11 primer dari 15
primer yang diuji adalah OPA 02, OPA 07, OPA 09, OPA 13, OPA 16, OPB 12, OPB17, OPB 18, OPD 02, OPD 08 dan OPD11. Adapun jenis
primer dan urutan nukleotida yang digunakan pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1 berikut:
Tabel 1. Jenis primer dan urutan nukleotida penyusunnya No
Primer Sequence 5’ to 3’
1 OPA-02 TGCCGAGCTG
2 OPA-07 GAAACGGGTG
3 OPA-09 GGGTAACGCC
4 OPA-13 CAGCACCCAC
5 OPA-16 AGCCAGCGAA
6 OPB-12 CCTTGACGCA
7 OPB-17 AGGGAACGAG
8 OPB-18 CCACAGCAGT
9 OPD-02 GGACCCAACC
10 OPD-08 GTGTGCCCCA
11 OPD-11 AGCGCCATTG
commit to user
20
Amplifikasi PCR dilakukan sebanyak 45 siklus yang terdiri dari beberapa tahap yaitu preheating 95
o
C selama 5 menit, denaturasi suhu 95
o
C selama 30 detik, annealing 36
o
C selama 30 detik, elongasi 72
o
C selama 1 menit dan elongasi akhir 72
o
C selama 5 menit. Proses elektroforesis dilakukan untuk mengetahui kenampakan pita DNA. Gel
hasil elektroforesis direndam dalam larutan Etidium Bromida EtBr selama 30 menit. Hasil elektroforesis diamati di bawah UV transluminator
kemudian difoto dengan kamera.
Analisis Data Keragaman genetik diamati dengan menentukan skor berdasarkan
ada atau tidaknya pita DNA. Pita DNA diterjemahkan dalam data biner, jika ada nilai 1 dan jika tidak ada nilai 0. Analisis pengelompokan
dilakukan secara cluster analysis menggunakan program NTSYSpc Numerical Taxonomy and Multivariative Analysis System versi 2.02
Rolhf, 1998 dengan metode Unweight Pair Group Method Arithmetic UPGMA fungsi SIMQUAL Similarity Qualitative. Matrik kemiripan
menggunakan koefisien Dice Rolhf, 1998, sehingga akan diperoleh dendrogram hubungan kekerabatan anggrek Coelogyne spp.
3. Teknik Hibridisasi untuk menambah ragam genetik anggrek hitam Coelogyne pandurata
Hasil kajian pertama dengan penanda morfologi dan kajian kedua dengan penanda molekuler diperoleh tetua terpilih C. rumphii yang
mempunyai kedekatan genetik dengan C. pandurata, yang akan digunakan sebagai bahan hibridisasi. Persilangan dilakukan di Pusat Konservasi
Tumbuhan Kebun Raya LIPI Bogor, dilanjutkan penumbuhan biji secara invitro di laboratorium Kultur Jaringan Kebon Raya Bogor dan di
Laboratorium Fisiologi dan Bioteknologi Fakultas Pertanian UNS. Bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi tetua
tanaman anggrek hitam C. pandurata dan tetua tanaman anggrek C. perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
21
rumphii. Alat yang digunakan adalah pinset, tusuk gigi, kertas label, benang, dan loupe.
Persilangan dilakukan pada pagi hari pukul 07.00 – 10.00 pada
tanaman yang telah mekar penuh dengan menyilangkan induk C. pandurata dan C. rumphii sebagai tetua jantan atau betina. Polinia ditransfer dari
anther ke stigma dengan menggunakan tusuk gigi steril. Persilangan dilakukan pada 4 individu yang berbunga sebagai ulangan, dengan metode
sebagai berikut: i crossing: C. pandurata sebagai induk betina yaitu polinia ditransfer ke dalam stigma antara dua bunga yang berbeda berasal
dari dua individu tanaman, ii reciprocal: C. pandurata sebagai induk jantan, iii selfing yaitu polinia ditransfer ke dalam stigma pada satu bunga
dalam satu tanaman. Setelah penyerbukan dilakukan pengamatan persentase keberhasilan
persilangan, buah rontok dan kemasakan buah serta terbentuknya protokorm diamati secara teratur.
4. Identifikasi hasil persilangan Coelogyne pandurata dengan Coelogyne rumphii berdasarkan analisis sitologi dan flow cytometry.
Penelitian dilakukan di Laboratorium Genetika dan Laboratorium Sitologi Pusat Penelitian Biologi LIPI-Bogor. Bahan yang digunakan dalam
penelitian ini meliputi tetua anggrek C. pandurata, tetua anggrek C. rumphii, F1 hasil persilangan
♀ C. pandurata x ♂ C. rumphii, F1 hasil persilangan
♀ C. rumphii x ♂ C. pandurata. Metode penelitian meliputi dua percobaan: Analisis Sitologi dan
Flow Cytometry a. Analisis Sitologi
Analisis sitologi ini dilakukan untuk mengetahui jumlah kromosom, bentuk kromosom dan ukuran kromosom tetua dan hasil silangannya. Cara
kerja: ujung akar sepanjang 1 cm dimasukkan ke dalam botol berisi 8- Hydroxyquinoline 0.002 M dan disimpan selama 24 jam pada suhu 20
C, selanjutnya ujung akar difiksasi dengan asam asetat 45 selama 10 menit,
akar dipindahkan ke dalam larutan HCL 1 N : asam asetat 45 3:1 pada perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
22
suhu 60 C selama 2-2.5 menit dipanaskan, pewarnaan akar menggunakan
orcein 2. Ujung akar dipotong sepanjang 1-2 mm, kemudian diletakkan diatas gelas objek dan ditutup dengan gelas penutup dengan media orcein
2, selanjutnya ujung akar dipijit atau dipukul-pukul halus dengan pinset dan dipanaskan, preparat diamati dengan mikroskop Olympus CX31. Sel
terpilih diamati dengan perbesaran 40 x 10, kromosom dihitung dengan perbesaran 1000 x. Dari tiap preparat yang berisi ujung akar, dipilih
beberapa sel yang menunjukkan fase metaphase dan tidak terjadi tumpang tindih antar sel dan antar kromosom, pada fase tersebut kromosom tampak
menyebar, sehingga memudahkan dalam pengamatan. Variabel pengamatan jumlah kromosom dilaksanakan dengan
menggunakan metode squash menurut Darnaedi 1991 dan Manton 1950. Pengamatan meliputi jumlah kromosom, ukuran kromosom dan
bentuk kromosom. Penentuan bentuk kromosom mengacu pada cara Ciupercescu et al. 1990 cit. Parjanto et al. 2003, dapat dilihat pada
Tabel 2. Tabel 2. Bentuk kromosom berdasarkan rasio lengan kromosom
Bentuk kromosom Rasio lengan
⁄ Metasentrik m
Submetasentrik sm Akrosentrik a
Telosentrik t 1,0 r ≤ 1,7
1,7 r ≤ 3,0
3,0 r ≤ 7,0 ≥ 7,0
b. Analisis Flow Cytometry Analisis Flow Cytometry dilakukan untuk mengetahui tingkat ploidi
tetua dan hasil silangannya. Cara kerja: Potongan daun 0.5 cm2 dicacah menggunakan silet di dalam cawan petri yang berisi 250 µl buffer ekstraksi.
Setelah 30 – 90 detik buffer ekstraksi disaring menggunakan Partec 30 µl
Cell Trics filter. Pewarnaan menggunakan buffer PI Propidium Iodide dan RNAse 1 ml, selanjutnya diinkubasi selama 30 menit sebelum
dianalisis dalam flow cytometry. perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
23
5. Identifikasi hasil persilangan Coelogyne pandurata dengan Coelogyne rumphii menggunakan marka molekuler RAPD dan ISSR.
Penelitian dilakukan di Laboratorium Genetika Pusat Penelitian Biologi LIPI-Bogor. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi
tetua tanaman anggrek C. pandurata, tetua anggrek C. rumphii, F1 hasil persilangan
♀ C. pandurata x ♂ C. rumphii, F1 hasil persilangan ♀ C.
rumphi x
♂ C. pandurata.
Metode penelitian meliputi ekstraksi DNA, genom DNA diekstraksi mengikuti metodologi yang dijelaskan oleh Doyle dan Doyle 1987,
dengan beberapa modifikasi. Isolasi sampel daun segar + 0.4 g, daun segar digerus dengan pestle dalam tube 1.5 ml sampai halus, ditambah + 0.03 g
PVP dan + 0.1 g pasir kuarsa untuk membantu penggerusan, Memasukkan sampel yang sudah halus kedalam tube 1.5 ml yang telah
diisi dengan 800 ul buffer ekstraksi, kemudian diInkubasi dalam suhu 65
o
C selama 1 jam di waterbath. Ditambahkan 700 ul C:I chloroform:isoamil
alkohol, 24:1 dan di campur rata kemudian di sentrifuse dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu kamar. Mengambil supernatan yang
terbentuk 500 ul kemudian ditambahkan 500 ul Et-OH absolut kemudian diinkubasi dalam freezer -20
o
C selama 12 jam. Sentrifuse dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit, kemudian buang supernatan,
kemudian dikeringanginkan 15 menit, pellet dilarutkan dengan 300 ul ddH2O kemudian ditambah 15 ul RNAse 200 ug ml. Diinkubasi dalam
suhu 37
o
C selama 30 menit dan tambahkan 300 ul PCI phenol chloroform isoamilalkohol, 24:1:1 lalu di campur. Sentrifuse dengan kecepatan 12.000
rpm selama 15 menit dan mengambil 500 ul supernatan dan ditambahkan dengan 500 ul CI 24:1, dicampur rata kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit. Mengambil supernatan yang terbentuk dan tambahkan Et-OH absolut dengan volume 1:1 dan diinkubasi
dalam freezer -20
o
C selama 12 jam. Sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit. Buang supernatan dan cuci dengan alkohol 80 dan
dilakukan sentrifugasi lagi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit, perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
24
pelet dikeringkan dengan dikering anginkan. Pelet yang terbentuk diencerkan dengan 25 ul TE.
Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis dengan membandingkan dengan DNA lamda. Hal ini dilakukan untuk mengetahui
tingkat kualitas DNA: a. Agarose dibuat dan diletakkan dalam cetakan elektroforesis dan dibiarkan sampai padat, b. Gel agarose dimasukkan ke
dalam bak elektroforesis yang berisi buffer TAE, sampai terendam, c. DNA lambda disiapkan sebagai pembanding. d. Masing-masing DNA sampel
dicampur dengan loading dye sebagai pemberat, e. DNA lambda dan DNA sampel yang telah dicampur dengan loading dye dimasukkan pada sumuran
gel elektroforesis, kemudian dilakukan elektroforesis selama 57 menit pada voltase 50 volt, f. Gel hasil eletroforesis direndam dalam larutan Etidium
Bromida EtBr selama 30 menit, g. Hasil elektroforesis diamati di bawah UV transluminator kemudian difoto dengan kamera, h. Hasil foto dilihat
dan dibandingkan antara DNA sampel dengan DNA lambda, dengan ditandai ada atau tidaknya pita DNA.
Seleksi primer dari Operon Technology Operon Almaeda, 2000 digunakan untuk mendapatkan produk amplifikasi dengan tingkat
polimorfisme yang tinggi. Enam RAPD primer: OPA-02, OPA-07, OPB-12, OPB-17, OPB-18, OPD-
11 Operon Technology Ltd dan empat primer ISSR yang dipilih adalah primer yang digunakan pada anggrek Cattleya labiata Lucas et al., 2012
yaitu UBC 814, UBC 826, UBC 807 dan UBC 810 dan pada anggrek Cymbidium sinense Jiang et al., 2011 yaitu UBC 826 dan UBC 807.
Analisis data Analisis keragaman genetik berdasarkan data fragmen DNA yaitu ada
atau tidaknya pita DNA. Profil pita DNA diterjemahkan dalam data biner dengan ketentuan nilai 0 untuk tidak ada pita dan nilai 1 untuk ada pita
DNA pada satu posisi yang sama dari jenis anggrek yang dibandingkan. Untuk mengetahui besarnya keragaman maupun kemiripan genetik antar
individu tetua dan hasil persilangan dengan menggunakan analisis klaster atau gerombol. Analisis klaster dilakukan dengan program NTSYSpc versi
commit to user
25
2.02i dengan metode UPGMA Unweighted Pair Group Method of Arithmatic Average fungsi SimQual Rohlf, 1998.
commit to user
26
BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN