28
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel utama
a. Variabel bebas.Variabel bebas dalam penelitian ini adalah variasi dosis
pemberian infusa biji alpukat Persea americana Mill. b.
Variabel tergantung.Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah tolok ukur kuantitatif yang dilihat dari nilai LD
50
, sedangkan tolok ukur kualitatif yang dilihat dari gejala toksik, wujud, dan sifat efek toksik.
2. Variabel pengacau
a. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam
penelitian ini antara lain, mencit jantan dan betina galur Swiss, berat badan 20-30 g dari Lab Imono, umur 1,5-2,5 bulan, frekuensi pemberian infusa satu kali dalam
24 jam hari pertama, rute pemberian peroral, biji alpukat dari Es Teller 77 Galeria Yogyakarta pada bulan Juni 2014 yang diambil dari perkebunan Klaten yang
memiliki waktu panen yang sama, makanan dan minuman dari Lab Imuno.
b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali dalam
penelitian ini adalah kondisi patologis dan fisiologis mencit jantan dan mencit
betina galur Swiss yang digunakan.
3. Definisi operasional
a. Biji alpukat Persea americana Mill..
Biji alpukat Persea americana Mill. adalah biji alpukat berbentuk bulat yang diambil dari tanaman Persea
americana Mill. dengan warna kuning, segar, dan tidak bercacat. Biji digunakan
dalam bentuk serbuk yang dibuat di lab Farmakognosi Fitokimia Universitas Sanata Dharma.
b. Dosis infusa biji alpukat Persea americana Mill.. Infusa biji alpukat
Persea americana Mill. yang diperoleh dengan mengekstraksi sediaan herbal sebanyak 8 gram dengan pelarut aquadest 100,0 ml suhu 90
o
C selama 15 menit dengan konsentrasi 8 bv dibagi mejadi empat peringkat dosis dengan rentang
dosis dari yang tidak mematikan seluruh hewan uji sampai hampir atau mematikan seluruh hewan yaitu dosis I = 230,09 mgkgBB; dosis II = 520,00 mgkgBB; dosis
III = 1175,20 mgkgBB; dosis IV = 2655,95 mgkgBB. c.
Lethal dose 50 LD
50
. Lethal dose 50 adalah dosis tunggal suatu zat yang secara statistik diharapkan akan membunuh 50 hewan uji
d. Gejala. Gejala didefinisikan sebagai gejala klinis maupun toksik yang
muncul karena pemejanan infusa biji alpukat Persea americana Mill. yang meliputi gerakan tremor, konvulsi, paralisis, keterpaksaan gerak, tidur, reaktif
terhadap rangsangan dan refleks beringas, pasif, perubahan perilaku perubahan sikapaneh seperti lompat dan berputar berlebihan atau menggeliat, penjilatan,
pencakaran, vokalisasi luar biasa, gelisah, sekresi salivas, lakrimasi, nafas bradipnea, trakipnea, kardiovaskuler vasodilatasi, perubahan kulit dan bulu,
saluran cerna diare, sembelit Dipasquale dan Hayes, 2001 ; Badan POM, 2014.
e. Wujud. Wujud didefinisikan sebagai kecenderungan wujud perubahan
struktural yang dapat dilihat dari perubahan histopatologik organ hewan uji dengan membandingkan perbedaan organ mencit kontrol dan organ mencit yang diberi
perlakuan infusa biji alpukat. f.
Sifat. Sifat didefinisikan sebagai kecenderungan sifat efek toksik senyawa uji yang dapat dikategorikan menjadi sifat terbalikkan dan sifat tak terbalikkan
yang dilihat dari uji reverbilitas dan diidentifikasi melalui hasil histopatologik organ hewan uji.
C. Bahan Penelitian
1. Bahan utama
a. Hewan uji yang digunakan, yaitu mencit galur Swiss dengan umur 1,5-2,5 bulan dan berat badan 20-30 g yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penelitian dengan hewan coba telah mendapat ethical clearance dari Komisi Etik Fakultas Kedokteran
Universitas Gajah Mada Lampiran 7. b. Biji alpukat bentuk bulat Persea americana Mill. yang diperoleh dari Es
Teller 77 Galeria Yogyakarta pada bulan Juni 2014 yang diambil dari perkebunan Klaten yang memiliki waktu panen yang sama.
2. Bahan kimia
a. Pelarut untuk infusa dan kontrol negatif uji toksisitas akut digunakan
aquadest yang diperoleh dari Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
b. Pelet AD-2 digunakan sebagai asupan makan mencit sedangkan asupan
minum menggunakan air reverse osmose RO yang diperoleh dari Laboratorium Imono, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
c. Pengawet formalin 10 yang dibuat dengan mengencerkan formalin 30
dengan aquadest sesuai volume yang dikehendaki untuk mencapai konsentrasi 10. Formalin 30 diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
D. Alat atau Instrumen Penelitian 1.
Alat pembuat serbuk biji alpukat Persea americana Mill.
Timbangan digital, ayakan no.40, blender, oven, dan wadah penyimpanan
serbuk biji alpukat. 2.
Alat penetapan kadar air Timbangan, sendok, alat moisture balanced, stopwatch.
3. Alat pembuatan infusa biji alpukat Persea americana Mill.
Panci enamelware, termometer, stopwatch, Bekker glass, gelas ukur, cawan porselen, batang pengaduk, penangas air, timbangan analitik, kain flannel,
kompor listrik, corong, dan labu alas bulat.
4. Alat uji toksisitas dan pemeriksaan histopatologik
Seperangkat alat gelas berupa Bekker glass, gelas ukur, tabung reaksi, pipet tetes, timbangan elektrik, spuit per oral syringe 1 cc untuk pemejanan
aquadest dan infusa, alat bedah, pot penyimpan organ, mikroskop untuk memeriksa preparat histopatologi, kamera untuk memotret preparat histopatologi.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman Persea americana Mill
Determinasi dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan
Bahan uji yang digunakan adalah biji Persea americana Mill. yang diperoleh dari Es Teller 77 Galeria Yogyakarta pada bulan Juni 2014 yang
diambil dari perkebunan Klaten yang memiliki waktu panen dan waktu tumbuh yang sama.
3. Pembuatan serbuk biji alpukat
Serbuk dicuci bersih di bawah air mengalir, dipotong-potong, disortir dan dikeringanginkan hingga tidak tampak basah lagi kemudian pengeringan
dengan oven suhu kurang dari 60
o
C. Biji yg kering kemudian diserbukkan dan diayak menggunakan ayakan nomer 40 dan dicari persen rendemen yang
diperoleh pengayakan berhubungan dengan luas permukaan spesifik yang kontak dengan pelarut.
4. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill.
Sampel serbuk biji Persea americana Mill. yang sudah diayak sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam alat moisture balanced pada suhu 105
C selama 15 menit, kemudian persen kadar air akan muncul pada alat moisture balanced
secara otomatis.
5. Pembuatan infusa biji alpukat Persea americana Mill.
Caranya serbuk kering ditimbang 8,0 g dan dimasukkan dalam panci enamel lalu dibasahi dengan aquadest sebanyak 2 kali bobot bahan yang
ditimbang yakni 16 mL aquadest. Pelarut aquadest kemudian ditambahkan sebanyak 100,0 mL. Panci enamel dipanaskan pada suhu 90
C dan dijaga tetap dalam suhu tersebut selama 15 menit. Waktu 15 menit dihitung ketika suhu
campuran mencapai 90
o
C. Campuran tersebut setelah 15 menit diambil dan diperas selagi hangat dengan menggunakan kain flannel kemudian bila perlu
ditambahkan aquadest panas melalui ampas hingga didapatkan volume 100,0 mL infusa biji.
6. Penetapan dosis infusa Persea americana Mill.
Penetapan dosis didasarkan dosis yang digunakan pada masyarakat, yaitu kurang lebih 2 sendok makan 4g. Dosis pada manusia 4g70 kgBB. Dosis
dikonversi untuk mencit. Faktor konversi dari manusia 70kg ke mencit 20 g adalah 0,0026. Jadi dosis untuk mencit 20 g sebagai berikut :
Dosis infusa untuk mencit 20 g= 4g70kgBB X 0,0026 = 0,0104 g20gBB = 520 mgkgBB
Penetapan dosis maksimal dengan menggunakan volume maksimal 1 mL yang dapat diberikan pada mencit. Berat badan maksimal 30 g dan
menggunakan konsentrasi infusa maksimal yang dapat dibuat 8 bv Yoseph, 2013 adalah
DxBB = CxV
D x 30g = 8g100mL x 1 mL
D = 0,00267 ggBB = 2670 mgkgBB
Penelitian ini dibuat empat peringkat dosis dan dosis 520 mgkgBB digunakan sebagai dosis ke-2 sedangakan 2670 mgkgBB digunakan sebagai dosis ke-4.
Sehingga dari dosis peringkat tinggi dan peringkat rendah dicari faktor pengali yang berguna untuk peringkat dosis.
Faktor pengali = √
� � ��� �
�ℎ
�−
= √
2 0 ����� 20 �����
4−
=2,26 Peringkat dosis yang didapatkan, yaitu
Dosis I = 520 mgkgBB : 2,26
= 230,09 mgkgBB; Dosis II
= 520,00 mgkgBB; Dosis III
= 520 mgkgBB x 2,26 = 1175,20 mgkgBB;
Dosis IV = 1175,20 mgkgBB x 2,26 = 2655,95 mgkgBB.
7. Pengelompokkan dan perlakuan hewan uji
Penelitian ini membutuhkan lima puluh ekor mencit 25 jantan, 25 betina. Pengelompokan dilakukan dengan membagi secara acak lima puluh mencit ke
dalam lima kelompok perlakuan menggunakan undian, masing-masing kelompok sejumlah sepuluh ekor mencit 5 jantan, 5 betina. Kelompok I, yaitu
kontrol negatif yang diberi aquadest secara peroral. Kelompok perlakuan II
diberi infusa biji alpukat Persea americana Mill. dengan dosis terendah 230,09 mgkgBB. Kelompok perlakuan III diberi infusa biji alpukat Persea
americana Mill. dengan dosis peringkat ke 2, yaitu 520,00 mgkgBB.
Kelompok perlakuan IV diberi infusa biji alpukat Persea americana Mill. dengan dosis peringkat ke 3, yaitu 1175,20 mgkgBB. Kelompok perlakuan V
diberi infusa biji alpukat Persea americana Mill. dengan dosis tertinggi 2655,95 mgkgBB. Mencit diadaptasikan terlebih dahulu pada lingkungan uji
selama satu minggu. Mencit dipuasakan selama 3-4 jam sebelum perlakuan dengan tetap diberikan air minum setelah itu pemberian infusa biji Persea
americana Mill. dilakukan secara peroral, sekali hanya hari pertama. Analisis
dilakukan dengan melihat sebagai berikut. a. jumlah kematian,
b. gejala klinis dan efek toksik yang meliputi gerakan tremor, konvulsi, paralisis, keterpaksaan gerak, tidur, reaktif terhadap rangsangan dan refleks
beringas, pasif, perubahan perilaku perubahan sikapaneh seperti lompat dan berputar berlebihan atau menggeliat, penjilatan, pencakaran, vokalisasi luar
biasa, gelisah, sekresi salivas, lakrimasi, nafas bradipnea, trakipnea, kardiovaskuler vasodilatasi, perubahan kulit dan bulu, saluran cerna diare,
sembelit Dipasquale dan Hayes, 2001 ; Badan POM, 2014. c. histopatologis pada organ hati, ginjal, usus, limpa, lambung, jantung, dan
paru-paru setelah 24 jam dan dilanjutkan hingga 14 hari bila tidak terjadi kematian dan diamati pula histopatologisnya untuk mengetahui sifat efek toksik
setelah 24 jam dan setelah uji reversibilitas selama 14 hari. Proses pembuatan
preparat dan pemeriksaan histopatologik dilakukan di Laboratorium Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
F. Tata Cara Analisis Hasil
Data yang diperoleh dianalisis dan dievaluasi untuk memperoleh tolok ukur toksisitas baik kuantitatif maupun kualitatif. Analisisnya adalah sebagai berikut.
1. Data jumlah kematian masing-masing kelompok bila ada selama 24 jam
digunakan untuk mengetahui nilai LD
50.
2. Data gejala yang timbul setelah pemejanan diamati 24 jam dan dilanjutkan
sampai hari ke 14 bila tidak terjadi kematian. 3.
Data pemeriksaan histopatologi setelah 24 jam dan setelah 14 hari digunakan untuk mengevaluasi spektrum efek toksik yang timbul akibat pemejanan
sifat dan wujud efek toksik. 4.
Data perubahan berat badan dianalisis dengan tren perubahan purata berat badan pada hari ke 0,7, dan 14 untuk melihat apakah ada perubahan berat
badan dengan adanya pemberian infusa biji alpukat Persea americana Mill..
G. Skema Alur Penelitian
Gambar 1. Skema alur penelitian
Hewan uji dikelompokkan secara acak dan diadaptasikan selama 1 minggu sebelum memulai perlakuan
Hewan uji dipuasakan selama 3-4 jam sebelum perlakuan dengan tetap memberikan air minum
Hewan uji ditimbang dan dibandingkan antara hari ke 0, 7 maupun 14 Hewan uji diberi infusa biji alpukat secara peroral
Dosis 1
Infusa biji alpukat
230,09 mgkgBB
Dosis 2
Infusa biji alpukat
520,00 mgkgBB
Dosis 3
Infusa biji alpukat
1175,20 mgkgBB
Dosis 3
Infusa biji alpukat
2655,95 mgkgBB
Kel.Kontrol
Aquadest 33,33
gkgBB
Dilakukan pengamatan gejala sesering mungkin pada 6 jam pertama, dan dilanjutkan sampai hari 14 bila tidak ada kematian dan
jumlah kematian Setelah 24 jam, dilakukan pembedahan, diambil organ ginjal, usus,
limpa, jantung, paru-paru, hati, dan lambung untuk melihat histopatologiknya 2 jantan, 3 betina
Hewan uji sisa 3 jantan, 2 betina dibiarkan hidup tanpa pemberian infusa biji alpukat maupun aquadest selama 14 hari
untuk uji reversibilitas dan dilakukan pembedahan untuk melihat histopatologiknya.
50 ekor mencit yakni 25 jantan dan 25 betina masing-masing dibagi kedalam 5 kelompok
38
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini dilakukan dengan tujuan mendapatkan gambaran umum tentang toksisitas akut infusa biji alpukat Persea americana Mill. dan khususnya
mengetahui nilai ketoksikan akut yang dinyatakan dengan kisaran LD
50
, gejala toksik, wujud dan sifat akibat pemejanan infusa biji alpukat pada mencit galur
Swiss yang dilihat melalui pengamatan histopatologik.
A. Determinasi Biji Alpukat
Determinasi dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi UGM dengan tujuan untuk identifikasi, menghindari agar tidak ada kekeliruan dengan
tanaman lain sehingga memastikan bahwa tanaman yang dimaksud adalah Persea americana
Mill. Hasil determinasi yang dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi UGM menunjukkan bahwa tanaman benar-benar merupakan
tanaman alpukat dengan nama ilmiah Persea americana Mill. dan hasil determinasi dapat dilihat pada lampiran 6.
B. Penetapan Kadar Air Serbuk Kering Biji Persea americana Mill.
Penetapan kadar air dilakukan pada biji alpukat yang telah mengalami pengeringan dan berubah menjadi serbuk dengan tujuan untuk mengecilkan ukuran
partikel sehingga permukaan serbuk yang kontak dengan penyari dimana dalam penelitian ini adalah air semakin luas sehingga senyawa-senyawa yang terkandung
dalam biji alpukat dapat banyak tersari keluar. Penetapan kadar air dilakukan dengan menggunakan alat moisture balanced dan dilakukan sebagai salah satu
Kategori