maka dikatakan bahwa korteks adrenal berfungsi homeostatik, artinya penting bagi organisme untuk dapat mempertahankan diri dalam menghadapi perubahan
lingkungan Suherman dan Ascobat, 2007. Kortikosteroid merupakan obat-obat manjur terkuat dalam pengobatan
gangguan kulit dan digunakan secara luas. Berkat efek antiradang dan antimitosisnya yang menghambat atau mencegah pembelahan sel dapat
menyembuhkan dengan efektif bermacam-macam bentuk eksem dan dermatitis, psoriasis penyakit sisik, prurigo bintil-bintil gatal, berbagai rupa gatal-gatal,
dan lain-lain. Akan tetapi tidak jarang gangguan khususnya eksem segera kambuh lagi, terutama bila digunakan fluorkortikoida dengan khasiat kuat Tan
dan Rahardja, 2002.
2.3 Betametason
Betametason adalah obat kortikosteroid yang mengandung fluor, mempunyai daya kerja yang besar. Akan tetapi, penggunaan obat kortikosteroid
yang mengandung fluor dalam jangka waktu lama, dapat menyebabkan pelebaran kapiler dan pembuluh nadi halus yang bersifat permanen sampai terjadi atropi
kulit. Betametason dalam bentuk krim biasanya merupakan senyawa Betametason Valerat. Indikasi dari krim ini adalah alergi dan peradangan lokal. Pengobatan
dilakukan dengan mengoleskan tipis pada kulit 2–3 kali sehari Sartono, 1996. Betametason kurang aktif secara topikal, tetapi dengan mengikat 5 rantai
karbon valerat pada posisi hidroksil-17 menghasilkan suatu senyawa yang 300 kali lebih aktif dibandingkan dengan hidrokortison untuk pemakaian topikal
Katzung, 2004.
Betametason Celestone, Celestoderm adalah stereoisomer dari deksametason, di mana gugus-metil pada C
16
berada dalam posisi-beta. Daya antiradangnya pada penggunaan lokal lebih ringan. Zat ini digunakan dalam krim
sebagai valerat 0,1 atau dipropionat yang dua kali lebih kuat 0,05 Tan dan Rahardja, 2002.
Gambar 2.1 Struktur betametason valerat
Rumus molekul : C
27
H
37
FO
6
Berat molekul : 476,58
Betametason mengandung tidak kurang dari 90,0 dan tidak lebih dari 110,0 dari jumlah yang tertera pada etiket.
Nama kimia : 9-Fluoro-
11β,17,21-trihidroksi-16β-metilpregna-1,4-diena 3,20-dion 17-valerat
Pemerian : Serbuk, putih sampai hampir putih, tidak berbau
Kelarutan :Tidak larut dalam air, mudah larut dalam aseton dan kloroform,
larut dalam etanol, sukar larut dalam benzena dan eter Ditjen POM, 1995.
Farmakokinetik : Betametason secara topikal dapat diabsorpsi melalui kulit. Penggunaan jangka panjang atau pada daerah kulit yang luas
dapat menyebabkan efek sistemik, antara lain mempunyai kemampuan untuk supresi menekan korteks adrenal
Suherman dan Ascobat, 2007. Indikasi
: Alergi dan peradangan lokal Kontra indikasi : Infeksi bakteri, fungi, dan penyakit kulit yang disebabkan oleh
virus. Selain itu, penderita acne rosacea, dan perioral dermatitis.
Efek samping : Atropi lokal, gatal-gatal, hipopigmentasi, perioral dan alergi
dermatitis, serta infeksi sekunder Sartono, 1996.
2.3.1 Uji kualitatif betametason
Pengujian betametason dapat dilakukan dengan menggunakan metode Spektrofotometri dan Kromatografi Lapis Tipis KLT.
a. Metode Spektrofotometri Betametason dapat diidentifikasikan dengan mengukur serapannya pada
panjang gelombang tertentu dengan alat spektrofotometri. Dalam pelarut etanol yang direaksikan dengan fenilhidrazin–asam sulfat akan memberikan reaksi yang
berwarna kuning yang menunjukkan serapan maksimum sekitar 420–450 nm Schunack, dkk., 1990.
b. Metode Kromatografi Lapis Tipis KLT Kromatografi Lapis Tipis merupakan teknik pemisahan senyawa yang
menggunakan fase gerak zat cair dan fase tetap zat padat, dan menggunakan plat
kromatografi yang dibuat dengan membentangkan penjerap dalam lapisan tipis sebagai penyokong yang inert. Penjerap padat yang berbentuk bubukan halus
dibuat menjadi bubur dengan air dan dibentangkan diatas plat kaca. Plat yang telah dilapisi dipanaskan atau diaktifkan dengan jalan memanaskannya pada suhu
kira–kira 100ºC selama ± 30 menit. Campuran yang akan dikromatografi harus dilarutkan dalam pelarut yang
agak non polar untuk ditotolkan pada lapisan. Larutan uji ditotolkan pada plat kromatografi lapis tipis diikuti dengan penotolan larutan baku. Setelah dilakukan
pengelusian, lapisan tersebut kemudian disemprot dengan suatu pereaksi, yang akan menimbulkan bercak berwarna setelah bereaksi dengan cuplikan. Maka noda
larutan uji akan menunjukan warna dan harga Rf yang sama dengan noda larutan baku Gritter, dkk., 1991.
2.3.2 Uji kuantitatif betametason
Pengujian kuantitatif dari krim betametason dapat dilakukan dengan menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT. Kemajuan
dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sensitif telah menyebabkan perubahan kromatografi kolom cair menjadi suatu sistem
pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Metode ini dikenal sebagai kromatografi cair kinerja tinggi. Dengan teknologi ini kromatografi dalam banyak
hal dapat menghasilkan pemisahan yang sangat cepat seperti pada kromatografi gas, dengan keunggulan zat–zat yang tidak menguap atau tidak tahan panas dapat
dikromatografi tanpa peruraian atau tanpa perlunya membuat derivat yang dapat menguap Ditjen POM, 1995.
Yang penting pada kromatografi cair kinerja tinggi adalah penggunaan adsorben dengan partikel kecil
≤ 50 µm dan kolom yang kecil diameternya, yang di dalamnya mengalir pengelusi dengan tekanan tinggi 10–400 bar dengan
laju aliran tetap. Dengan cara ini didapat penyingkatan proses pemisahan yang besar dan akibatnya adalah terjadi pemisahan yang lebih baik. Dalam kebanyakan
hal kromatografi cair kinerja tinggi dilakukan sebagai kromatografi adsorpsi. Bobot molekul nisbi relatif senyawa yang terpisah biasanya terletak di antara
100 dan 2000 Schunack, dkk., 1990.
2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Metode kromatografi cair kinerja tinggi diperkenalkan pompa bertekanan tinggi dan perkembangan detektor yang sangat peka telah membangkitkan
perhatian pada kromatografi kolom, yang semula menjadi kurang penting dan kurang menguntungkan sebagai akibat penggunaan lapis tipis. Bidang baru dalam
kromatografi kolom adalah kromatografi cair kinerja tinggi KCKT atau High Performance Liquid Chromatography HPLC, yang pada dasarnya perbaikan
dalam laju aliran, karena pada kromatografi kolom klasik laju aliran sangat rendah. Aliran dapat dipercepat hingga 1 ml permenit dengan menggunakan
tekanan tinggi Sardjoko, 1993. Metode kromatografi cair digunakan kolom tabung gelas dengan
bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stationer. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa
sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase bergerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu yang
lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoretis kolom. Kromatografi cair kinerja tinggi atau
high performance liquid chromatography HPLC berbeda dari kromatografi cair klasik. Kromatografi cair kinerja tinggi menggunakan kolom dengan diameter
umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 µm sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi Khopkar, 1990.
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam. Pada saat pengisian sampel, sampel digelontor
melewati keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel
dan menggelontorkan sampel ke kolom. Presisi penyuntikan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai standar deviasi relatif 0,1 Rohman, 2007.
Kromatografi cair kinerja tinggi dilengkapi dengan detektor 254 nm, pengukuran dapat dilakukan pada panjang gelombang serapan maksimum lebih
kurang 240 nm. Kolom 4 mm x 30 cm berisi bahan pengisi dan pompa yang dapat dijalankan pada tekanan kolom hingga 3500 psi. Perbandingan luas puncak
terkecil dan terbesar, R
s
pada tiga kali penyuntikan ulang larutan baku tidak lebih dari 2,0 . Tetapkan perbandingan tinggi puncak pada waktu retensi yang sama
dari larutan uji dan larutan baku Ditjen POM, 1995. Kromatografi cair kinerja tinggi dengan prinsip kromatografi adsorpsi
banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida. Zat-zat dengan kepolaran
berbeda, yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan kromatografi cair kinerja tinggi berdasarkan partisi cair-cair. Luas puncak
kromatografi pada kurva elusi dipengaruhi oleh tiga proses perpindahan massa yaitu difusi Eddy, difusi longitudinal dan transfer massa tidak setimbang
Khopkar, 1990. Pada kromatografi cair kinerja tinggi KCKT menggunakan pelarut atau fase
gerak yang mempunyai sifat seperti : −Murni, tanpa cemaran.
−Tidak bereaksi dengan kemasan. −Sesuai dengan detektor.
−Dapat melarutkan cuplikan. −Mempunyai viskositas rendah.
−Memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, jika diperlukan. −Harganya wajar Johnson dan Stevenson, 1991.
Menurut De Lux Putra, 2007, komponen-komponen penting dari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT yaitu:
Gambar 2.2 Diagram blok kromatografi cair kinerja tinggi.
Pada dasarnya alat kromatografi cair terdiri dari sistem pompa, sistem penyuntik, tendon pelarut, kolom kromatografi, detektor, penguat sinyal dan perekam.
1.Sistem pompa Pompa harus mampu menghasilkan tekanan 6000 Psi pada kecepatan alir
0,1-10 mlmenit. Pompa ada 2 jenis yaitu pompa volume konstan dan pompa tekanan konstan. Pompa terbuat dari bahan yang inert terhadap semua pelarut De
Lux Putra, 2007. Sebagian besar pompa kromatografi cair kinerja tinggi mempunyai
keluaran tekanan 1000-6000 psi, dan mampu menghasilkan aliran sampai 20 mlmenit. Pompa jenis putaran sekrup screw driven pump dan pompa tarik
dorong reciprocating pump sering digunakan Khopkar, 1990. 2.Pipa
Pipa merupakan penyambung seluruh bagian sistem. Garis tengah dalam pipa sebelum penyuntik tidak berpengaruh, hanya saja harus lembam dan tahan
tekanan serta mampu melewatkan pelarut dengan volume yang memadai. Tetapi garis tengah dan panjang pipa setelah penyuntikan sangat menentukan sistem
penyuntik Munson, 1991. 3.Sistem penyuntik
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat
penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel sample loop internal atau eksternal Rohman, 2007.
Sampel dimasukkan dalam sistem injeksi dengan penyuntik hiperdemik. Sampel sampai sejumlah 2-100 µl dapat ditampung dalam sistem injeksinya.
Suatu septum dari silikon atau teflon digunakan sehingga sistem injeksi dapat tertutup dengan sendirinya Khopkar, 1990.
4.Fase gerak Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan
metanol atau campuran air dengan asetonitril Rohman, 2007. Fase diam menggunakan silika gel, yang dalam molekulnya terdapat rantai
oktadesil yang terikat secara kimia, ikatannya stabil terhadap hidrolisis dan mempunyai gabungan sifat hidrofilik dan hidrofobik, karena pada ujung rantai
terdapat gugus eter silil dan alkil pada bagian tengah. Fase gerak merupakan campuran antara metanol atau asetonitril dengan air atau larutan dapar. Pada
penggunaan fase gerak yang mengandung air, ikatan kimia fase diam mempunyai sifat seperti sistem terbalik Sardjoko, 1993.
5.Kolom kromatografi Kolom merupakan jantung kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan
analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
a. Kolom analitik : garis tengah-dalam 2-6 mm. Panjang bergantung pada jenis
kemasan, untuk kemasan partikel biasanya panjang kolom 50–100 cm, untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya 10–30 cm.
b. Kolom preparatif : umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan
panjang 25–100 cm Johnson dan Stevenson, 1991. Dalam hal ini dianjurkan untuk memasang penyaring μm dijalur antara penyuntik
dan kolom, untuk menahan partikel yang dibawa fase gerak atau terokan. Selama penggunaan penyaring ini sering tersumbat dan perlu diganti. Hal ini dapat
memperpanjang umur kolom Munson, 1991. 6.Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom analisis kualitatif dan menghitung kadamya analisis kuantitatif.
Detektor Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk
mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas De Lux Putra, 2007. 7.Perekam
Perekam merupakan salah satu dari bagian peralatan yang berfungsi untuk merekam atau menunjukan hasil pemeriksaan suatu senyawa berupa peak
puncak. Dari daftar tersebut secara kualitatif kita dapat mengetahui senyawa apa yang diperiksa, dan secara kuantitatif dapat diketahui luas dan tinggi puncak yang
berbanding lurus dengan konsentrasi. Kromatografi cair kinerja tinggi KCKT mempunyai beberapa
keuntungan bila dibandingkan dengan sistem pemisahan lain, diantaranya :
1. Proses cepat, untuk analisis yang tidak rumit, dapat dicapai waktu analisis
kurang dari 5 menit. 2.
Daya pisahnya baik, kemampuan linarut berinteraksi secara selektif dengan fase diam dan fase gerak memberikan parameter tambahan untuk mencapai
pemisahan yang dikehendaki. 3.
Detektor yang peka dan unik, detektor yang digunakan adalah UV 254 nm yang dapat mendeteksi berbagai jenis senyawa dalam jumlah nanogram.
4. Kolom dapat dipakai kembali, tetapi mutunya menurun. Laju penurunan mutu
tergantung pada jenis cuplikan yang disuntikan, kemurnian pelarut, dan jenis pelarut yang dipakai.
5. Ideal untuk molekul besar dan ion
6. Mudah memperoleh kembali cuplikan karena detektor tidak merusak
cuplikan. Pelarut dapat dihilangkan dengan penguapan Johnson dan Stevenson, 1991.
BAB III METODE PENGUJIAN
3.1 Tempat Pelaksanaan Penetapan Kadar
Penetapan kadar ini dilakukan di Ruang Laboratorium yang terdapat di Industri PT. Kimia Farma Persero Tbk. Plant Medan yamg beralamat di Jalan
Sisingamangaraja Km. 9 No. 59, Medan.
3.2 Alat-alat
Alat–alat yang digunakan adalah batang pengaduk, beaker glass pyrex, botol vial, maat pipet, membran filter
Phenex NY 0,45 μm, labu tentukur pyrex, neraca analitik digital semi micro balance, unit peralatan kromatografi
cair kinerja tinggi Waters yang terdiri dari detektor UVVis merk Waters 2489, kolom bondapack C18 3,9 x 300 mm, penyuntik mikroliter 100 µl, pompa
merk Waters 1525, spuit 10 ml, ultrasonic, wadah fase gerak.
3.3 Bahan–bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah akuades, akuabides, asam asetat glasial, asetonitril, betametason valerat, krim betametason 0,1 , metanol.
3.4 Penyiapan Bahan 3.4.1 Pembuatan pelarut
Dicampur larutan metanol 1000 ml dengan 1 ml asam asetat glasial kedalam botol pelarut.
3.4.2 Pengambilan sampel uji
Dari 1 batch diambil sebanyak 10 tube, dihitung bobot masing-masing krim dan diperoleh bobot rata-ratanya yaitu sebesar: 1000,35 mg dan 1000,33 mg.
3.4.3 Larutan standar
Ditimbang seksama sebanyak 25 mg betametason valerat, masukkan kedalam labu tentukur 50 ml, dimasukkan ± 35 ml metanol-asam asetat glasial
1000 : 1 lalu dilarutkan dengan ultrasonic selama 15 menit, ditambahkan lagi pelarutnya hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 500
µgml. Kemudian dipipet sebanyak 1,0 ml, masukkan kedalam labu tentukur 25 ml, dan dicukupkan hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan
konsentrasi 20 µgml, lalu kocok, disaring larutan dengan saringan millipore 0,45 µm dan dimasukkan kedalam botol vial. Kemudian diinjeksikan sebanyak 20 µl
kesistem KCKT. Dilakukan sebanyak 6 kali pengulangan.
3.4.4 Larutan uji
Ditimbang seksama sebanyak 1 gr krim, masukkan kedalam beaker glass 100 ml, dimasukkan ± 35 ml metanol-asam asetat glasial 1000 : 1, lalu
dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml dan larutkan dengan ultrasonic selama 15 menit. Kemudian ditambahkan lagi pelarutnya hingga garis tanda sehingga
diperoleh larutan dengan konsentrasi 20 µgml, lalu kocok, disaring larutan dengan saringan millipore 0,45 µm dan masukkan ke dalam botol vial. Kemudian
diinjekkan sebanyak 20 µl kesistem KCKT.
3.4.5 Larutan fase gerak
Fase gerak: asetonitril–akuabides 60 : 40, saring dan bebas gaskan.