kadar lemak, kadar serat kasar dan fermentable sugars serta kandungan makro dan mikro elemen. Masing-masing langkah analisis bahan baku dapat dilihat pada
Lampiran 1.
3.4.1.2 Isolasi B. thuringiensis
Metode isolasi yang digunakan adalah metode cawan tuang. Campuran spora kristal dari cultur collection dan cairan usus ulat sutra digoreskan ke dalam
agar miring secara aseptis. Kemudian kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30-32
o
C. Masing-masing kultur diambil satu lup ke dalam larutan 9 ml garam fisiologis dan dilakukan renjatan panas pada suhu 80
o
C selama 10-15 menit. Larutan selanjutnya diencerkan berseri sampai pada pengenceran 10
-7
dan sebanyak 1 ml dari masing-masing pengenceran disebarkan dalam medium agar
pH 7,4. Biakan dalam cawan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30-32
o
C. Koloni-koloni yang terpisah dan bentuk yang berbeda selanjutnya dibiakkan
dalam agar miring. Masing-masing kultur dalam agar miring ini selanjutnya dilakukan pengamatan mikroskopik menggunakan mikroskop dan Scanning
Electron Microscopy SEM.
Sebanyak satu lup isolat kemudian diinokulasikan ke dalam Nutrient Broth dan dikocok dalam rotary shaker selama 24 jam dengan kecepatan 180 rpm.
Untuk mempelajari pengaruh jenis media pada isolat bakteri yang dihasilkan maka disiapkan media kultivasi yang berbeda terdiri dari dua macam media yaitu:
1. Media M1 : Nutrient Broth NB.
2. Media M2 : Limbah cair tahu
Ke dalam masing-masing media M1 dan M2 yang telah disterilisasi secara aseptis diinokulasikan kultur dari NB sebanyak 10 dan dikocok dalam rotary
shaker selama 48 jam dengan kecepatan 180 rpm. Selanjutnya dilakukan
penentuan jumlah sel hidup, jumlah spora dan daya toksisitasnya terhadap C. binotalis.
Prosedur penentuan jumlah sel hidup, jumlah spora dan daya toksisitas bioinsektisida dapat dilihat pada Lampiran 2.
Untuk mengetahui perbedaan pengaruh perlakuan, data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan ANOVA. Rancangan percobaan yang digunakan
adalah rancangan acak lengkap faktorial yang terdiri dari dua faktor yaitu faktor jenis media M dan isolat bakteri B dengan dua kali ulangan . Faktor jenis
media terdiri dari media NB M1 dan media LCT M2. Faktor isolat bakteri meliputi isolat dari Balitvet yang koloni tak bertitik B1, isolat dari Balitvet yang
koloninya bertitik B2 serta isolat dari ulat B3. Model matematis yang digunakan untuk percobaan ini sebagai berikut Hanafiah 2005:
Y
ijk
= µ + α
i
+ β
j
+ αβ
ij
+ ε
ijk
Keterangan : Y
ijk
= nilai variabel respon unit percobaan yang dikenai taraf ke-i faktor jenis media dan isolat bakteri ke-j.
µ = nilai rata-rata pengamatan yang sesungguhnya.
α
i
= pengaruh aditif dari jenis media ke-i.
β
j
= pengaruh aditif dari isolat bakteri ke-j.
αβ
ij
= pengaruh interaksi antara jenis media ke-i faktor dan isolat bakteri ke-j. Σ
kij
= pengaruh galat dari satuan percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan.
Parameter yang diamati meliputi total sel hidup dan jumlah spora. Apabila hasilnya menunjukkan perbedaan yang nyata, maka analisis dilanjutkan dengan
uji Duncan menggunakan program SPSS.
3.4.2 Penentuan rasio karbonnitrogen media
3.4.2.1 Persiapan inokulum
Hasil seleksi galur B. thuringiensis yang memberikan daya toksisitas terbaik pada tahap pertama kemudian akan digunakan pada proses penentuan rasio
CN pada media. Persiapan inokulum medium fermentasi dilakukan dengan
mengikuti metode Vandekar dan Dulmage 1982. Satu lup biakan B. thuringiensis
diinokulasi dalam 50 ml media NB labu pembibitan I dan diinkubasi dalam rotary shaking incubator, dengan kecepatan 181 rpm, pada suhu
28-32
o
C, selama 12 jam. Kultur selanjutnya digunakan untuk menginokulasi labu pembibitan II berisi limbah cair tahu dengan komposisi kultur 5 dari volume
media pembibitan II. Labu pembibitan II diinokulasi pada kondisi yang sama selama 12 jam.
