2
1.2 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk
mengevaluasi kinerja bakteri probiotik Bacillus NP5 terhadap sintasan dan respon imun udang vaname setelah diinfeksi
IMNV Infectious Myonecrosis Virus.
2 METODE
2.1 Materi Uji 2.1.1 Persiapan Wadah
Wadah yang digunakan adalah akuarium kaca berukuran 60 cm x 30 cm x 35 cm sebanyak 15 unit. Sebelum digunakan, akuarium dicuci dengan air bersih
dan dikeringkan. Setelah itu, tiap akuarium diisi air bersih hingga 35 cm dan ditambahkan klorin sebanyak 30 µL.L
-1
kemudian dibiarkan selama 24 jam. Air laut ditampung di dalam tandon dan ditambahkan klorin sebanyak 30 µl.L
-1
kemudian dibiarkan selama 24 jam. Setelah itu, air laut ditambah Na-Thiosulfat sebanyak 15 µL.L
-1
dan diaerasi selama 24 jam. Sebagian air laut dikeluarkan dari akuarium hingga volume air laut yang tersisa sebanyak 20 L. Tiap akuarium
dilengkapi dengan aerasi, lampu pijar bohlam, plastik hitam sebagai penutup dinding akuarium, dan paralon berukuran 2,54 cm x 15 cm sebagai tempat
berlindung udang. Bagian atas akuarium ditutup waring untuk mencegah udang meloncat keluar dari akuarium.
2.1.2 Persiapan Probiotik
Biakan murni bakteri probiotik Bacillus NP5 yang digunakan diperoleh dari Laboratorium Kesehatan Organisme Akuatik, Departemen Budidaya Perairan,
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Sebelum diberikan ke udang, bakteri probiotik Bacillus NP5 diberi penanda resistensi
terhadap rifampisin Rf
R
dosis 25 μg.mL
-1
supaya dapat dimonitor keberadaannya pada udang. Bakteri probiotik Bacillus NP5 dikultur pada media Sea Water
Complete SWC agar 5 g bacto peptone, 1 g yeast extract, 3 mL gliserol, 15 g bacto agar, 750 mL air laut, dan 250 mL akuades; Lampiran 1 dan diinkubasi
selama 24 jam di dalam inkubator dengan suhu 29
o
C. Selanjutnya, bakteri yang sudah dikultur pada media SWC agar diinokulasi sebanyak satu ose pada media
SWC cair 25 mL dan diinkubasi pada waterbath shaker kecepatan 140 rpm, suhu 29
o
C selama 24 jam kepadatan yang diperoleh yaitu 10
8
cfu.mL
-1
. Setelah itu, dilakukan pemisahan antara sel bakteri dengan media dengan cara suspensi
bakteri dimasukkan sebanyak 1 mL ke dalam tabung mikro dan disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm selama lima menit. Supernatan dibuang, kemudian
padatan sel bakteri ditambah larutan fisiologis NaCl 0,8 sebanyak 1 mL lalu dihomogenkan dengan vortex. Setelah itu, suspensi bakteri disentrifugasi kembali
dengan kecepatan 6.000 rpm selama lima menit. Larutan fisiologis tersebut dibuang, kemudian padatan sel bakteri ditambah larutan fisiologis baru sebanyak
1 mL dan dihomogenkan dengan vortex. Setelah itu dilakukan pengenceran
3 berseri sesuai dosis percobaan Lampiran 2. Suspensi bakteri probiotik Bacillus
NP5 di dalam tabung mikro ke-1; kepadatan 10
8
cfu.mL
-1
dipipet sebanyak 100 µL lalu dicampur ke dalam tabung mikro lain tabung mikro ke-2 yang berisi 900
µL larutan fisiologis dan dihomogenisasi dengan vortex kepadatan yang dicapai pada tahap ini yaitu 10
7
cfu.mL
-1
. Selanjutnya, suspensi bakteri probiotik Bacillus NP5 di dalam tabung mikro ke-2 dipipet sebanyak 100 µL dan dicampur ke dalam
tabung mikro ke-3 yang telah diisi larutan fisiologis 900 µL kepadatan yang dicapai pada tahap ini yaitu 10
6
cfu.mL
-1
. Langkah yang sama tersebut terus dilakukan hingga mendapat kepadatan bakteri 10
4
cfu.mL
-1
. Tabung mikro dengan kepadatan 10
8
cfu.mL
-1
, 10
6
cfu.mL
-1
, dan 10
4
cfu.mL
-1
diambil untuk dilakukan ke tahap persiapan pakan uji.
2.1.3 Persiapan Pakan Uji
Pakan yang digunakan adalah pakan komersial dengan kadar protein 35. Proses persiapan pakan uji meliputi pencampuran bakteri probiotik Bacillus NP5,
putih telur, dan pakan. Dosis probiotik yang digunakan sebanyak 1 vw dari bobot pakan yang diberikan dan dosis putih telur yang digunakan sebanyak 2
vw dari bobot pakan sebagai perekat Wang 2007. Pakan ditimbang sesuai biomassa udang dan FR Feeding Rate; SNI 01-7246-2006 tiap akuarium.
Suspensi bakteri tiap perlakuan dicampur dengan putih telur sebelum dicampur ke pakan. Setelah itu, campuran probiotik dan putih telur disebarkan ke pakan dan
diaduk rata. Sebelum diberikan ke udang, pakan dikeringudarakan selama 5-10 menit pada suhu 24-25
o
C.
2.1.4 Persiapan Hewan Uji
Udang vaname diperoleh dari PT Suri Tani Pemuka Carita, Pandeglang, Banten. Sebelum digunakan, udang vaname stadia PL13 dipelihara untuk adaptasi
selama 30 hari dalam bak plastik berukuran 2 m x 1 m x 0,6 m. Selama adaptasi, udang diberi pakan komersial dengan kandungan protein 40 setiap pukul 08.00,
11.00, 14.00, dan 17.00 WIB yang jumlahnya disesuaikan dengan FR. Setelah 30 hari pemeliharaan, udang vaname dengan rerata bobot 2,41±0,07 g dipindahkan
ke akuarium uji sebanyak 10 ekor tiap wadah.
2.1.5 Persiapan Infeksi IMNV
Uji tantang yang dilakukan dalam penelitian ini adalah infeksi IMNV melalui metode injeksi. Udang vaname positif IMNV didapat dari Laboratorium
Kesehatan Organisme Akuatik. Pembuatan ekstrak IMNV berdasarkan prosedur yang dilakukan Escobedo et al. 2006. Prosedur pembuatan ekstrak IMNV yaitu
daging udang positif IMNV dicacah tanpa hepatopankreas, usus, dan karapas dan kemudian dihomogenkan dalam larutan fisiologis 1:10 wv. Setelah itu
disentrifugasi dengan kecepatan 6.500 rpm pada suhu 4
o
C selama 20 menit. Supernatan diambil dan dimasukkan dalam tabung mikro baru, kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm 4
o
C selama 20 menit. Selanjutnya supernatan diambil dan disaring dengan syringe filter
0,45 μm. Hasil penyaringan itu merupakan stok ekstrak IMNV dan disimpan pada suhu -70
o
C sampai akan digunakan. Udang diinjeksi dengan IMNV pada bagian punggung
antara segmen 3 dan 4 sebanyak 100 μL Tang et al. 2005. Pengamatan sintasan
dan gejala klinis dilakukan selama 14 hari setelah udang diinfeksi.
Kategori