akuarium, setara degan 14 liter. Sebanyak 100 gram sedimen yang didapatkan dari tempat budidaya lobster air tawar Godean
Yogyakarta dimasukkan dalam akuarium yang telah berisi air. Rumah lobster dan aerator dimasukkan dalam akuarium 1 rumah
dan 1 aerator per akuarium. Sebanyak 15 ekor lobster yang memenuhi kriteria secara acak dimasukkan dalam akuarium.
4. Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan pada masing-masing kelompok kelompok kontrol dan kelompok perlakuan sesuai dengan label pada akuarium
pada hari ke-0, ke-3, ke-5, ke-7, ke-14, ke-28. Sampel yang digunakan dalam penelitian adalah air, sedimen, dan lobster. Sampel air digunakan untuk
mendapatkan data jumlah koloni mikroba. Sampel sedimen digunakan untuk mendapatkan data kadar protein. Sampel lobster digunakan untuk mendapatkan
data pertumbuhan lobster. a.
Pengambilan sampel lobster. Lobster dikeluarkan dari akuarium, dihitung panjang masing-masing lobster dengan menggunakan penggaris dan
berat menggunakan timbangan untuk mendapatkan data pertumbuhan. b.
Pengambilan sampel air. Air dalam akuarium diaduk hingga homogen dan ditunggu selama 5 menit hingga partikel sedimen mengendap
kemudian dilakukan pengambilan air pada area didekat sedimen dengan spuit yang telah dimodifikasi secara random 100 ml dimasukkan dalam
botol steril yang disediakan oleh Balai Kesehatan Yogyakarta.
c. Pengambilan sampel sedimen. Air dalam akuarium diaduk hingga
homogen dan ditunggu selama 5 menit hingga partikel sedimen mengendap. Air dibuang secara perlahan, dan sedimen ditampung dalam
botol. Dilakukan penyedotan air dengan vakum pada sedimen yang didapatkan. Sedimen dikumpulkan dan dihomogenkan.
5. Penetapan Jumlah Koloni Mikroba CFU dalam Sampel Air
Sampel air yang telah dimasukkan dalam botol steril, dilakukan pengujian jumlah koloni mikroba CFU oleh bagian Laboratorium Mikrobiologi
Balai Kesehatan Yogyakarta. Data yang didapatkan dilakukan evaluasi hasil.
6. Penetapan Kadar Protein dalam Sampel Sedimen
a. Optimasi
1 Optimasi pelarut reagen CBB R-250
a Pembuatan reagen CBB formula 1
45 akuabides, 45 metanol, 10 asam asetat glasial dan 0,03 bv CBB. Sebanyak 150 mg CBB dilarutkan dalam 225
ml metanol, ditambahkan asam asetat glasial 50 ml dan ditambahkan akuabides hingga tanda batas pada labu takar 500
ml Anonim, 2006. b
Pembuatan reagen CBB dengan pelarut buffer acetate pH 4 buffer acetate dibuat dari natrium asetat sebanyak 0,41 gram dan
asam asetat 5,74 ml ditambahkan akuabides hingga tanda batas dalam labu takar 50 ml. Sebanyak 150 mg CBB dilarutkan
dalam 250 ml metanol, 50 ml buffer acetate dan ditambahkan akuabides hingga tanda batas dalam labu takar 500 ml.
c Pembuatan reagen CBB dengan pelarut Phosphate Buffer Saline
PBS Sebanyak 150 mg CBB dilarutkan dalam PBS hingga tanda
batas dalam labu takar 500 ml. d
Pembuatan reagen CBB dengan pelarut PBS–metanol Sebanyak 150 mg CBB dilarutkan dengan 250 ml metanol, 50
ml PBS, ditambahkan akuabides hingga tanda batas dalam labu takar 500 ml.
e Pembuatan reagen formula modifikasi
100 mg CBB, 200 ml Phosphate Buffer Saline PBS, dan 100 ml etanol. Sebanyak 30 ml diambil dari campuran, ditambahkan
80 ml PBS dan 37,5 ml etanol dan ditambahkan akuabides hingga tanda batas dalam labu takar 1000 ml.
f Pembuatan larutan stok albumin
Sebanyak 250 mg albumin dilarutkan dalam akuabides sebanyak 50 ml hingga tanda batas dalam labu takar 50 ml.
g Analisis kuantitatif dengan spectrophotometer visible
Sebanyak 1 ml dari larutan albumin 5 mgml dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan reagen sesuai dengan pelarut
hingga tanda batas dan ditunggu selama 15 menit. Sampel dicek
spektrum dengan menggunakan spectrophotometer visible pada 400-750 nm. Hasil spektrum yang didapat dibandingkan.
2 Perbandingan reagen CBB R-250 dalam pelarut PBS-metanol dan
pelarut formula modifikasi a Pembuatan reagen CBB dengan pelarut PBS-metanol
Sebanyak 25 mg CBB dilarutkan dengan 250 ml metanol, 50 ml PBS, ditambahkan akuabides hingga tanda batas dalam labu
takar 500 ml. b Pembuatan reagen formula modifikasi
100 mg CBB, 200 ml PHospHat Buffer Saline PBS, dan 100 ml etanol. Sebanyak 30 ml diambil dari campuran, ditambahkan
80 ml PBS dan 37,5 ml etanol dan ditambahkan akuabides hingga tanda batas dalam labu takar 1000 ml.
c Pembuatan seri baku albumin BSA Sebanyak 1000 mg albumin ditimbang dan dimasukkan dalam
labu takar 50 ml, ditambahkan PBS hingga tanda batas. d Analisis kuantitatif dengan spectrophotometer visible
1 Reagen dengan pelarut PBS-metanol Sebanyak 1 ml larutan albumin 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 mgml
dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan reagen CBB dengan pelarut PBS-metanol hingga tanda batas,
ditunggu selama 15 menit. Sampel dicek spektrum dengan spectrophotometer visible pada 400-750 nm. Hasil spektrum
diderivatisasi menggunakan orde 2 dengan delta lambda 20. Hasil derivatisasi dibandingkan.
2 Reagen dengan pelarut formula modifikasi Sebanyak 1 ml larutan albumin 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 mgml
dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan reagen CBB dengan pelarut CBB modifikasi hingga tanda batas,
ditunggu selama 10 menit. Sampel dicek spektrum dengan spectrophotometer visible pada 400-750 nm. Hasil spektrum
diderivatisasi menggunakan orde 2 dengan delta lambda 20. Hasil derivatisasi dibandingkan.
3 Optimasi operating time OT metode CBB
Sebanyak 1 ml larutan albumin 1 mgml dimasukkan dalam labu takar 5 ml, ditambahkan reagen CBB hingga tanda batas, ditunggu
OT selama 5, 10, 15, 20, dan 30 menit. Setelah OT, sampel dicek spektrum dengan spectrophotometer visible pada 400-750 nm. Hasil
spektrum dibandingkan. 4
Penentuan lamda maksimum Dari hasil optimasi operating time yang paling optimum, dilihat
lamda yang memiliki nilai serapan absorbansi paling tinggi. Nilai lamda yang memiliki nilai serapan absrobansi paling tinggi
dinyatakan sebagai lamda maksimum. 5
Optimasi volume pengambilan sampel terhadap CBB a pembuatan larutan albumin BSA 20 mgml
Sebanyak 1000 mg albumin ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar 50 ml, ditambahkan PBS hingga tanda batas.
b Pembuatan seri baku albumin BSA 1 Preparasi pengambilan larutan albumin 0,1 ml
Albumin dibuat dengan konsentrasi 6, 8, 10, 12, 14 mgml yaitu diambil sebanyak 3, 4, 5, 6, 7 ml diambil dari larutan
stok dimasukkan dalam labu takar 10 ml, ditambahkan PBS hingga tanda batas.
2 Preparasi pengambilan larutan albumin 1 ml Albumin dibuat dengan konsentrasi 6, 8, 10, 12, 14 mgml
yaitu diambil sebanyak 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 ml diambil dari larutan stok dimasukkan dalam labu takar 10 ml,
ditambahkan PBS hingga tanda batas. c Analisis kuantitatif dengan spectrophotometer visible
1 Pengambilan larutan albumin 0,1 ml Sebanyak 0,1 ml larutan albumin konsentrasi 6, 8, 10, 12,
14 mgml dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan reagen CBB hingga tanda batas, ditunggu
selama 15 menit. Sampel dicek spektrum dengan spectrophotometer visible pada 400-750 nm. Dilakukan
derivatisasi pada orde 2 dengan delta lamda 20. Hasil dibandingkan.
2 Pengambilan larutan albumin 1 ml Sebanyak 1 ml larutan albumin 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 mgml
dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan reagen CBB hingga tanda batas, ditunggu selama 15 menit. Sampel
dicek spektrum dengan spectrophotometer visible pada 400- 750 nm. Dilakukan derivatisasi pada orde 2 dengan delta
lamda 20. Hasil dibandingkan. 6
Optimasi waktu pemanasan pada ekstraksi protein dalam sedimen Proses ekstraksi pada penelitian ini mengacu pada penelitian
sebelumnya yang dilakukan oleh Mayer, Schick, dan Setchell 1986. Dalam proses ekstraksi dilakukan tahapan optimasi untuk
menentukan metode yang paling tepat digunakan. a Preparasi optimasi ekstraksi protein
Flakon sebanyak 9 buah disiapkan dan diberi label A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2, C3. Sedimen kering ditimbang sebanyak
0,2 gram dan dimasukkan dalam masing-masing flakon lalu ditambahkan natrium hidroksida 0,1 N sebanyak 6 ml.
Campuran dalam flakon ditutup, divortex lalu ditunggu selama 1,5 jam OT pada suhu 60
o
C di dalam oven untuk flakon A1, A2, dan A3. Campuran dalam flakon ditutup, divortex lalu
ditunggu selama 2 jam OT pada suhu 60
o
C di dalam oven untuk flakon B1, B2, dan B3. Campuran dalam flakon ditutup,
divortex lalu ditunggu selama 2,5 jam OT pada suhu 60
o
C di
dalam oven untuk flakon C1, C2, dan C3. Setelah OT, masing- masing campuran disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit.
Masing-masing supernatan diambil sebanyak 4 ml dan pH dinetralkan dengan HCl 2,5 N dengan ditetes secara perlahan
hingga pH 7-8, lalu dimasukkan dalam labu takar 5 ml, ditambahkan PBS hingga tanda batas.
b Analisis kuantitatif dengan spectrophotometer visible Sebanyak 1 ml larutan dari flakon A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1,
C2, C3. Masing-masing dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan reagen CBB hingga tanda batas, ditunggu selama
15 menit. Sampel dicek spektrum dengan spectrophotometer visible pada 400-750 nm. Dilakukan derivatisasi pada orde 2
dengan delta lamda 20. Hasil dibandingkan. b.
Validasi 1 Linearitas
a Pembuatan stok Bouvin Serum Albumin BSA 40 mgml Sebanyak 2 gram albumin BSA dimasukkan dalam labu takar
50 ml dan ditambahkan PBS hingga tanda batas. b Pembuatan seri baku albumin BSA
Sebanyak 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 µl dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan PBS
hingga tanda batas. Konsentrasi dibuat 0,80; 1,20; 1,60; 2,00; 2,40; 2,80; 3,40; 3,60; 4,00mgml.
c Analisis dengan spectrophotometer visible Sebanyak 1 ml diambil dari setiap seri baku dimasukkan dalam
labu takar 5 ml dan ditambahkan reagen CBB hingga tanda batas dan ditunggu selama 15 menit. Sampel dicek spektrum
dengan menggunakan spectrophotometer visible pada 400 - 750 nm. Hasil dideriviatisasi pada orde 2 dengan delta lamda 20.
d Pembuatan kurva baku Setiap konsentrasi pada hasil derivatisasi diplotkan dan dicari
nilai r dan persamaan regresi liniernya. 2 Akurasi
Dilakukan pencarian nilai D 3 LOD
Kurva baku digunakan untuk melihat LOD sensitivitas instrumen, yang didapatkan dari pengaplikasian dengan rumus.
4 Presisi Dilakukan pencarian nilai RSD
5 Kurva adisi Flakon disiapkan sebanyak 6 buah, dilabeli dengan nama A, B, C, D,
E, F. Sedimen kering ditimbang sebanyak 0,2 gram dan dimasukkan dalam flakon A, B, C, D, E, F. Standar albumin BSA ditimbang
sebanyak 10, 30, 50, 70, dan 90 mg dicampurkan dengan sedimen dalam flakon B, C, D, E, F. Flakon A, B, C, D, E, F ditambahkan
natrium hidroksida 0,1 N sebanyak 6 ml menggunakan makropipet.
Campuran dalam flakon ditutup, divortex lalu ditunggu selama 2 jam OT pada suhu 60
o
C. Setelah OT, campuran disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 4 ml dan pH
dinetralkan dengan ±0,1 ml HCl 2,5 N dengan ditetes secara perlahan hingga pH 7-8, lalu dimasukkan dalam labu takar 5 ml,
ditambahkan PBS hingga tanda batas. Kemudian dilakukan pengenceran, diambil 1 ml dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml di
add dengan menggunakan PBS hingga tanda batas. Diambil 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml di add dengan
menggunakan reagen. Dilakukan replikasi 2 kali dan dicek spektrum dengan spectrophotometer visible pada panjang gelombang 400-750
nm. c.
Penentuan kadar 1 Preparasi NaOH 0,1 N dan HCl 2,5 N
NaOH kualitas p.a ditimbang sebanyak 0,4 gram, ditambahkan akuabides dalam labu takar 100 ml hingga batas tanda. HCl kualitas
p.a diambil 2,083 ml diencerkan dengan akuabides dalam labu takar 10 ml hingga batas tanda.
2 Preparasi Phosphate Buffer Saline PBS Sebanyak 4 gram NaCl, 0,2 gram KCl, 0,72 gram Na
2
HPO
4
, dan 0,12 gram KH
2
PO
4
ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar 500 ml, ditambahkan akuabides hingga tanda batas.
3 Preparasi reagen Coomasie Brilliant Blue CBB
Sebanyak 10 mg CBB ditimbang dan dilarutkan dalam 20 ml PBS dan 10 ml etanol, disebut campuran A. Sebanyak 3 ml campuran A
dimasukkan dalam labu takar 100 ml. Ditambahkan 8 ml PBS dan 3,75 ml etanol kemudian ditambahkan akuabides hingga tanda batas
4 Ekstraksi protein dalam sedimen Air akuarium didekantir dan sedimen diambil seluruhnya,
dimasukkan dalam botol sampel. Sedimen disaring menggunakan corong buchner dan pompa vacuum hingga kering. Sedimen kering
dimasukkan dalam mortir dan digerus dengan stamper hingga homogen. Sedimen ditimbang sebanyak 0,2 gram dimasukkan dalam
flakon dan ditambahkan NaOH 0,1 N sebanyak 6 ml dengan menggunakan makropipet. Campuran diaduk dan divortex hingga
homogen lalu dimasukkan dalam oven dengan suhu 60 C, ditunggu
selama 2 jam. Setelah 2 jam, dikeluarkan dari oven dan disentrifuge dengan kecepatan putar 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan
diambil sebanyak 4 ml ditambahkan HCl 2,5 N dengan ditetes secara perlahan hingga pH 7-8 kemudian dimasukkan dalam labu takar 5 ml
ditambahkan PBS hingga tanda batas 5 Analisis kuantitatif dengan spectrophotometer visible
Blanko dibuat dari seluruh pelarut dan reagen yang digunakan tanpa ada sampel. Blanko dimasukkan dalam kuvet, dilakukan baseline
terhadap spectrophotometer visible. Sampel dalam labu takar diambil sebanyak 1 ml dimasukkan dalam labu takar 5 ml. Reagen
CBB ditambahkan dalam labu takar hingga tanda batas dan dilakukan operating time hingga 15 menit. Setelah 15 menit,
campuran dimasukkan dalam kuvet dan dicek absorbansi dengan spectrophotometer visible pada spektrum 400-750 nm. Spektra yang
keluar diderivatisasi level kedua kemudian dilakukan pengukuran tinggi puncak derivat.
7. Penetapan Panjang dan Berat pada Lobster
