Uji Aktifitas Nematisidal Jamur Endofit secara In Vitro Isolasi Jamur Endofit

Rahmad Lingga : Uji Nematisidal Jamur Endofit Tanaman Padi Oryza sativa L. Terhadap Nematoda Puru Akar Meloidogyne SPP., 2010. yang berumur satu minggu. Isolat nematoda dituangkan ke bagian akar muda yang ditanam pada tanah yang steril. Selanjutnya, nematoda diekstraksi kembali setelah satu bulan. Gambar 2.2.1. Juvenil Stadium 2 Meloidogyne spp.

3.4 Isolasi dan Perbanyakan Endofit

Isolasi fungi endofit dari akar padi dilakukan dengan metode Radu and Kqueen 2002 dengan modifikasi. Akar dan batang padi dicuci dengan air mengalir selama 20 menit, dikeringkan dengan tissu, disterilisasi dengan etanol 2 menit, natrium hipoklorit 5,3 selama 5 menit. Terakhir dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 kali, dan dikeringkan dengan kertas saring steril. Batang padi dipotong 4 bagian dan sedangkan bagian akar dihaluskan terlebih dahulu kemudian diambil ekstraknya, diletakkan pada media PDA. Jamur endofit yang diperoleh diinkubasi pada suhu ruang selama 5 hari. Koloni jamur yang diperoleh dibuat biakan murninya untuk diidentifikasi berdasarkan ukuran, bentuk, pinggir, warna permukaan bawah koloni, serta pengamatan mikroskopik hifa.

3.5 Uji Aktifitas Nematisidal Jamur Endofit secara In Vitro

Rahmad Lingga : Uji Nematisidal Jamur Endofit Tanaman Padi Oryza sativa L. Terhadap Nematoda Puru Akar Meloidogyne SPP., 2010. Uji nematisidal jamur endofit dilakukan terhadap ekstrak jamur endofit. Koloni biakan murni jamur endofit yang berumur 6 hari ditambahkan dengan 0,2 ml streptomisin sulfat 0,1, digerus dengan jarum ose yang ujungnya dibengkokkan dan ditampung ekstraknya. Ekstrak jamur dituangkan ke dalam microwhell, diinokulasikan sebanyak 100 juvenil nematoda puru akar Lampiran A, diinkubasi pada suhu ruang. pengamatan mortalitas juvenil nematoda puru akar Lampiran A dilakukan setelah 24 jam dengan mempergunakan mikroskop cahaya. Nematoda dapat dianggap mati apabila tidak menunjukkan pergerakan setelah disentuh dengan jarum. Uji nematisidal In vitro ini dilakukan dengan Rancangan Acak Lengkap RAL Non Faktorial. Perlakuan terdiri dari jamur endofit, air, dan ekstrak agar. Setiap perlakuan dibuat dengan 3 kali ulangan.

3.6 Uji Nematisidal Jamur Endofit secara In Vivo

3.6.1 Inokulasi Jamur Endofit dan Nematoda Puru Akar

Uji Nematisidal Jamur Endofit secara In vivo dilakukan pada tanaman padi yang berumur 1 minggu. Bibit tanaman padi dicabut dan direndam dalam suspensi spora jamur endofit dengan kerapatan 10 7 selama satu jam. Pada minggu selanjutnya diinroduksikan juvenil nematoda puru akar dengan cara penuangan pada bagian akar. Selanjutnya, enam minggu setelah infeksi akar padi tersebut dicabut untuk menentukan kemampuan aktifitas nematisidal jamur endofit tersebut. Kemampuan aktivitas nematisidal jamur endofit ditentukan dari jumlah puru akar yang ditemukan pada akar tanaman padi perlakuan. Rahmad Lingga : Uji Nematisidal Jamur Endofit Tanaman Padi Oryza sativa L. Terhadap Nematoda Puru Akar Meloidogyne SPP., 2010.

3.6.2 Evaluasi Ketahanan terhadap Nematoda Puru Akar

Evaluasi ketahanan ditentukan dengan menggunakan Metode Sasser et al. 1984, yaitu dengan menentukan indeks puru dan faktor reproduksi. Indeks puru akar ditentukan dengan Metode Canto-Saenz 1985, yaitu dengan menghitung jumlah puru Lampiran A, selanjutnya diskoring sebagai berikut : 1. Skala 0 : tidak ada puru akar 2. Skala 1 : terdapat 1-15 puru 3. Skala 2 : terdapat 16-35 puru 4. Skala 3 : terdapat 36-50 puru 5. Skala 4 : terdapat 51-100 puru 6. Skala 5 : terdapat lebih dari 100 puru Populasi akhir nematoda dihitung dengan menjumlahkan jumlah populasi nematoda di akar dan populasi di tanah. Akar tanaman akan diekstraksi dengan metode Corong Bearman yang dimodifikasi serta dihitung jumlah individu yang diperoleh. Selanjutnya tanah bekas media pertumbuhan tanaman dalam polibag juga diekstraksi dengan metode yang sama untuk memperoleh jumlah populasi yang terdapat dalam tanah. Sebanyak 100 gram tanah perlakuan diekstraksi dan dihitung jumlah individu nematoda, dilakukan sebanyak 3 ulangan. Jumlah populasi tersebut dihitung rata-ratanya, dikonversikan dengan volume total tanah perlakuan Lampiran E. Rahmad Lingga : Uji Nematisidal Jamur Endofit Tanaman Padi Oryza sativa L. Terhadap Nematoda Puru Akar Meloidogyne SPP., 2010. Faktor reproduksi pf ditentukan dengan membandingkan jumlah populasi awal dengan jumlah populasi akhir, dengan rumus: pf = p0pi dimana : pf = faktor reproduksi pi = populasi akhir total p0 = populasi awal yang diinokluasi

3.6.3 Pengamatan Pertumbuhan Tanaman

Pengamatan pengaruh jamur endofit terhadap pertumbuhan tanaman dilakukan dengan mengukur adalah berat tajuk gram, tinggi tanaman cm, serta panjang akar cm. Tanaman perlakuan dicabut dan dipisahkan bagian akarnya. Berat tajuk tanaman diukur dengan menimbang bagian atas tanaman. Sedangkan untuk parameter tinggi tanaman diukur dari bagian pangkal akar sampai ujung daun tertinggi Lampiran A. Sedangkan panjang akar diukur mulai dari pangkal akar sampai bagian ujung akar tanaman. Rahmad Lingga : Uji Nematisidal Jamur Endofit Tanaman Padi Oryza sativa L. Terhadap Nematoda Puru Akar Meloidogyne SPP., 2010. BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi Jamur Endofit

Hasil isolasi jamur endofit dari tanaman padi diperoleh sebanyak 10 isolat yang terdiri dari 5 genus, 3 famili dan 3 ordo serta berasal dari 2 kelas yaitu Ascomycetes dan Zigomycetes. Kelima genus isolat tersebut adalah Aspegillus, Cochliobolus, Mucor, Penicillium dan Monascus Tabel 4.1. Kelas Ascomycetes merupakan kelas yang paling banyak diisolasi yaitu sebanyak 9 isolat, sedangkan Kelas Zigomycetes yang diisolasi hanya 1 genus. Tabel 4.1 Isolat Jamur Endofit yang diperoleh dari tanaman padi GenusSpesies Famili Ordo Kelas Aspergillus sp 1 Eurotiaceae Eurotiales Ascomycetes Aspergillus sp 2 Eurotiaceae Eurotiales Ascomycetes Aspergillus sp 3 Eurotiaceae Eurotiales Ascomycetes Aspergillus sp 4 Eurotiaceae Eurotiales Ascomycetes Aspergillus sp 5 Eurotiaceae Eurotiales Ascomycetes Aspergillus sp 6 Eurotiaceae Eurotiales Ascomycetes Cochliobolus lunatus Pleosporaceae Pleosporales Ascomycetes Rahmad Lingga : Uji Nematisidal Jamur Endofit Tanaman Padi Oryza sativa L. Terhadap Nematoda Puru Akar Meloidogyne SPP., 2010. Monascus sp. Monascaceae Eurotiales Ascomycetes Mucor sp. Mucoraceae Mucorales Zygomycetes Penicillium sp. Eurotiales Eurotiales Ascomycetes Aspergillus merupakan genus yang paling banyak ditemukan dengan persentase kehadiran sebesar 60. Sedangkan genus lainnya hanya ditemukan masing-masing 1 isolat dengan persentase kehadiran 10 Gambar 4.1. Hal ini mungkin dikarenakan Aspergillus merupakan jamur yang bersifat kosmopolitan tersebar di seluruh permukaan bumi. Gambar 4.1 Persentase kehadiran genus yang diisolasi dari tanaman padi Genus Aspergillus hasil isolasi memiliki karakteristik yang berbeda untuk masing- masing isolat. Perbedaan tersebut dapat dilihat dari warna permukaan atas koloni, warna permukaan bawah koloni, tekstur permukaan koloni, serta bentuk konidianya Tabel 4.1.2. Genus ini memiliki ciri mikroskopis yang mudah dibedakan dengan jamur lain, yaitu memiliki konidiofor yang tegak, tidak bersepta, tidak bercabang dan ujungnya membengkak membentuk vesikel. Pada permukaaan vesikel terbentuk phialid yang Rahmad Lingga : Uji Nematisidal Jamur Endofit Tanaman Padi Oryza sativa L. Terhadap Nematoda Puru Akar Meloidogyne SPP., 2010. menghasilkan konidia. Aspergillus merupakan jamur yang memiliki keragaman jenis yang cukup tinggi, terdapat sekitar 180 jenis anamorf dan 70 jenis teleomorf Samsons et al ., 1995. Genus ini memiliki kemampuan dalam mengikat N bebas dan melarutkan pospat dalam tanah Goenadi et al., 1995. Genus ini juga memiliki fungsi yang sangat penting bagi tanaman, karena dapat melarutkan pospat dan mengikat nitrogen Rao, 1982. Tabel 4.2 Karakteristik Isolat Jamur Endofit yang diperoleh dari tanaman padi Jenis Warna Koloni Permukaan Koloni Konidia Atas Bawah Aspergillus Sp.1 Hijau krem Hijau Kasar Ovate Aspergillus Sp.2 Cokelat kekuningan Krem Halus Ovate Aspergillus Sp.3 Kuning kecokelatan Cokelat Halus Ovate Aspergillus Sp.4 Hijau kecokelatan Abu-abu Kasar Ovate Aspergillus sp.5 Hijau Hijau Halus Globose Aspergillus sp.6 Hitam Hitam Kasar Ovate Cochliobolus lunatus Hitam abu-abu Hitam Halus Geniculate Monascus sp. Putih Kuning kemerahan Halus Ovate Mucor sp. Krem kekuningan Krem Kasar Ovate Penicillium sp. Hijau Hijau krem Kasar Globose Isolat Cochliobolus lunatus yang diperoleh memiliki ciri koloni yang berwarna hitam abu-abu, konidia geniculate Tabel 4.2. Menurut Gandjar et al.2000 spesies ini Rahmad Lingga : Uji Nematisidal Jamur Endofit Tanaman Padi Oryza sativa L. Terhadap Nematoda Puru Akar Meloidogyne SPP., 2010. bersifat heterotalik. Askomata terbentuk sesudah perkawinan dari hifa pada stromata berbentuk kolumnar, dan pematangan setelah 20 hari. Spesies ini banyak sekali ditemukan di daerah tropis, terutama pada tumbuh-tumbuhan, dan telah diisolasi dari sawah, perkebunan, kacang-kacangan, rhizosfer padi. Spesies ini memiliki suhu pertumbuhan optimum 24 C-30 C. Spesies ini dapat bertahan hidup selama 2 tahun dalam tanah dalam bentuk sklerotia. Isolat Penicillium sp. yang diperoleh memiliki ciri koloni yang berwarna hijau krem, permukaan kasar Tabel 4.2 Menurut Gilman 1971 Genus Penicillium memiliki hifa vegetatif yang menjalar, bersekat, dan pada bagian apeks memiliki vertisilia yang muncul dari percabangan primer yang tegak lurus, dan masing-masing vertisilia memilki percabangan sekunder metula dan terkadang memiliki percabangan tersier phialid. Konidianya berbentuk globose, bulat telur oval atau elips, halus ataupun kasar Genus ini merupakan jamur yang kosmopolit yang bersifat saprofit dan parasit pada tanaman tingkat tinggi. Penicillium digitatum misalnya telah berhasil diisolasi dari tanaman padi dan jagung Samsons et al., 1995. Monascus sp. yang diisolasi memiliki karakter warna koloni putih dengan warna sebalik koloni berwarna kuning kemerahan, konidia ovate Tabel 4.2, memiliki khlamidospora dan hifa yang bersekat. Menurut Hawksworth dan Pitt 1983, Monascus adalah sejenis kapang yang tidak banyak ditemukan di alam dan umumnya ditemukan dalam produk makanan misalnya beras. Beras yang difermentasi dengan jamur ini akan berwarna merah yang biasanya dikenal dengan nama angkak. Komponen utama dari pigmen ini adalah rubropunktatin berwarna merah, monaskorubin juga berwarna merah, monaskin berwarna kuning, ankaflavin juga berwarna kuning, rubropunktamin berwarna ungu dan monaskorubramin yang juga berwarna ungu Suwanto, 1985. Monascus juga menghasilkan produk metabolit sekunder yang dihasilkan oleh setelah fase stasioner pada pertumbuhan yaitu Lovastatin Brown dan Goldstein, 1991. Rahmad Lingga : Uji Nematisidal Jamur Endofit Tanaman Padi Oryza sativa L. Terhadap Nematoda Puru Akar Meloidogyne SPP., 2010. Mucor sp. yang diisolasi memiliki karakteristik warna koloni berwarna krem, tekstur permukaan kasar, dan konidia bentuk ovateTabel 4.2. Menurut Gilman 1971, miselium Mucor tersebar luas di dalam atau diluar substrat, tanpa rhizoid, dan umumnya memiliki banyak percabangan. Sporangia biasanya tegak lurus pada simpodial sporangiospor, dan memiliki banyak warna. Memiliki kolumela, dengan variasi bentuk dan tipe, ada yang berwarna dan ada yang tidak. Raymond and Poitcelot 1978 dalam Hidayati 2005 menyatakan Mucor termasuk kelompok jamur termofilik dan hidup dalam kondisi asam serta mampu mendegradasi senyawa kompleks menjadi senyawa organik sederhana. 4.2 Kemampuan Nematisidal secara In vitro Uji nematisidal jamur endofit terhadap Meloidogyne spp. secara in vitro menunjukkan bahwa isolat Monascus sp. dan Aspergillus sp1 memiliki kemampuan tertinggi dalam membunuh juvenil Meloidogyne spp. adalah perlakuan isolat Monascus sp. menyebabkan mortalitas juvenil Meloidogyne spp. sebesar 45 dan Aspergillus sp1 sebesar 39,33 Tabel 4.3. Hal ini menunjukkan bahwa isolat Monascus sp. dan Aspergillus sp1 memiliki kemampuan dalam membunuh juvenil Meloidogyne spp. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh toksin yang dihasilkan jamur tersebut. Sesuai dengan pernyataan Sayre 1971 menyatakan bahwa mekanisme pengendalian nematoda oleh jamur diduga akibat pengaruh toksin yang dihasilkan jamur yang berpengaruh negatif terhadap kehidupan nematoda parasit. Selanjutnya Hawksworth dan Pitt 1983 menyatakan Monascus sp. merupakan jamur yang banyak menghasilkan metabolit sekunder, seperti Lovastatin yang diaplikasikan untuk menurunkan kadar kolesterol darah, menghasilkan antibiotik Brown dan Goldstein, 1991. Selanjutnya Gronvold et al. 1993 menyatakan bahwa beberapa jenis jamur dapat membuat perangkap atau penjerat pada saat larva bergerak mengenai hifa. Jamur tersebut juga mampu mengeluarkan zat kemoatraktan dan enzim Rahmad Lingga : Uji Nematisidal Jamur Endofit Tanaman Padi Oryza sativa L. Terhadap Nematoda Puru Akar Meloidogyne SPP., 2010. pengurai kutikula, sehingga larva melekat dan selanjutnya terjadi penguraian lapisan kutikula yang menyebabkan kematian larva nematoda tersebut. Peneliti lain membuktikan bahwa jamur oportunistik dapat mengkolonisasi nematoda betina sebelum nematoda tersebut bertelur Sayre, 1971. Tabel 4.3 Mortalitas juvenil Meloidogyne spp. akibat pengaruh pemberian ekstrak jamur endofit. Perlakuan 24 Jam Mortalitas Air 11.00 d Monascus sp. 45.00 a Aspergillus sp1 39.33 a Aspergillus sp2 21.00 c Aspergillus sp3 23.00 b Aspergillus sp4 15.33 c Aspergillus sp5 17.33 c Aspergillus sp6 22.67 bc Cochliobolus lunatus 22.33 bc Mucor sp. 16.00 c Penicillium sp. 21.67 bc Keterangan: Huruf yang berbeda menunjukkan nilai yang berbeda nyata berdasarkan uji Dunc an, = 0, 05.

4.3 Kemampuan Nematisidal Jamur Endofit terhadap Meloidogyne spp. secara