BAHAN TEMPAT DAN WAKTU PENGAMATAN KEMAMPUAN BELAJAR

III. BAHAN DAN METODE

A. BAHAN

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari : kecap dan saus cabe, hewan percobaan, ransum serta bahan-bahan kimia. Kecap dan saus cabe yang digunakan adalah dari jenis yang difortifikasi dengan iodium, zat besi dan vitamin A. Kedua produk ini memiliki merek dagang “Nasional”, diperoleh dari PD. Sari Sedap. Kecap dan saus cabe diambil dari perusahaan satu minggu setelah diproduksi. Dengan demikian umur kecap saat mulai analisis adalah tujuh hari satu minggu. Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus jenis Sprague dawley. Tikus berjenis kelamin betina dengan umur sapih 3 minggu dalam kondisi sehat. Ransum yang diberikan pada hewan percobaan sesuai dengan yang direkomendasikan AOAC 1984. Ransum terdiri dari sumber protein, selulosa CMC, minyak minyak jagung, multivitamin, multimineral, tepung maizena dan air. Ransum untuk perlakuan dibedakan menjadi ransum dengan dan tanpa mineral I dan Fe. Bahan-bahan kimia diperlukan untuk penguj ian mikrobiologi, ana lisis kandungan I, Fe, vitamin A kecap dan saus cabe, analisis hemoglobin Hb dan retinol serum serta analisis histologi otak.

B. TEMPAT DAN WAKTU

Penelitian berlangsung dari bulan Februari – Oktober 2005. Penelitian dilakukan di Bagian Biokimia Pangan, Laboratorium Hewan Percobaan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan ITP Fakultas Teknologi Pertanian FATETA IPB, Bagian Histologi Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan FKH IPB, serta Laboratorium Kimia Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pasca Panen Pertanian.

C. METODE PENELITIAN

Penelitian ini dibagi menjadi empat bagian, dengan bagan penelitian dapat dilihat pada Gambar 3. 21 Gambar 3 Bagan dari penelitian yang dilakukan

BAGIAN I : PENDUGAAN UMUR SIMPAN

A. Pengamatan perubahan sifat fisikokimia, mikrobiologis dari produk kecap dan saus cabe selama penyimpanan B. Pendugaan umur simpan produk kecap dan saus cabe berdasarkan karakteristik fisikokimianya

BAGIAN II : UJI STABILITAS I, Fe, VIT.A

A. Pengamatan perubahan nilai gizi iodium I, zat besi Fe dan vit. A yang difortifikasikan pada produk kecap dan saus cabe selama penyimpanan B. Pendugaan stabilitas I, Fe dan vit. A yang difortifikasikan pada produk kecap dan saus cabe

BAGIAN III : UJI BIOLOGIS TERHADAP INDUK TIKUS

A. Pengujian nilai biologis I, Fe dan vit. A dari produk kecap dan saus cabe menggunakan hewan coba tikus, berdasarkan penilaian biokimia darah B. Pengujian manfaat iodium pada produk kecap dan saus cabe dalam mempengaruhi kemampuan belajar tikus percobaan

BAGIAN IV : UJI BIOLOGIS TERHADAP ANAK TIKUS

A. Pengamatan terhadap jumlah anak, tingkat kelangsungan hidup serta berat lahir B. Pengujian manfaat iodium pada produk kecap dan saus cabe dalam mempengaruhi kemampuan belajar tikus percobaan 22

1. PENELITIAN BAGIAN I : PENDUGAAN UMUR SIMPAN

Pada penelitian bagian pertama dilakukan pengamatan perubahan sifat fisik, kimia dan mikrobiologis. Selanjutnya dilakukan pendugaan umur simpan berdasarkan karakteristik fisikokmianya, yang meliputi : viskositas, total padatan terlarut, pH dan warna. Bagan alir penelitian bagian pertama dapat dilihat pada Gambar 4. Gambar 4 Bagan alir penelitian bagian I Produk kecap dan saus cabe disimpan dalam inkubator pada suhu 27°C, 43°C dan 55°C. Selanjutnya dilakukan pengamatan fisikokimia pada masing- masing suhu penyimpanan, pada periode pengamatan tertentu. Untuk pengamatan mikrobiologis, produk hanya disimpan pada suhu 27°C saja. Data hasil pengamatan fisikokimia digunakan untuk PROD U K Kecap Saus cabe PEN YI M PAN AN Suhu : 27°C 4 3 °C 5 5 °C PEN GAM ATAN FI SI KOKI M I A Periode : hari ke- 0,14,28,42,56 Param et er : 1 . Viskosit as 2 . Tot al padat an t erlarut 3 . pH 4 . Warna PEN GAM ATAN MI KROBI OLOGI S Periode : hari ke- 0,14,28,5 2 Param et er : S t ot al m ikroba PEN D UGAAN UM UR SI M PAN M et ode Arrhenius PEN YI M PAN AN Suhu : 27°C 23 menduga umur simpan kecap dan saus cabe berdasarkan karakteristik fisikokimia. Prosedur pengamatan dapat dilihat seperti di bawah ini :

a. Pengamatan Fisikokimia 1

Pengukuran Viskositas Pengukuran viskositas menggunakan alat viskometer. Nilai pada skala yang terbaca pada alat menunjukkan besarnya viskositas, yang dinyatakan dalam centipois cp 2 Pengukuran Total Padatan Terlarut Pengukuran total padatan terlarut menggunakan alat refraktometer. Larutan yang akan diukur diteteskan pada prisma refraktometer. Nilai pada skala yang terbaca pada batas gelap dan terang menunjukkan besarnya total padatan terlarut dalam satuan derajat Brix. 3 Pengukuran pH Pengukuran pH dilakukan dengan pH- meter yang dikalibrasi oleh buffer pH 4 dan 7. Kalibrasi dilakukan setiap awal pengukuran. 4 Pengukuran Warna Analisis warna dilakukan dengan “Color Measurement and Difference CalculationDigital Display System” model MINOLTA CAMERA seri Cr-200 Minolta co. Ltd.-Japan. Secara otomatis alat mengukur tingkat kecerahan L, intensitas warna merah a dan intensitas warna kuning b.

b. Pengamatan Mikrobiologis

Untuk penentuan total mikroba, media yang digunakan adalah Plate Count Agar PCA. Sampel dari produk dimasukkan ke dalam cawan petri steril pada tiga tingkat pengenceran. Kemudian pada cawan tersebut dituang PCA steril sebanyak 15-20 ml. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar dan dilakukan pengamatan serta penghitungan jumlah mikroba pada hari ke-0,14,28 dan 52. 24

c. Pendugaan Umur Simpan

Umur simpan produk kecap dan saus cabe yang didasarkan pada perubahan karakteristik fisikokimianya ditentukan dengan model pendekatan Arrhenius. Penurunan mutu bahan pangan diasumsikan mengikuti reaksi ordo nol, dimana perubahan parameter yang diukur konstan terhadap waktu, mengikuti persamaan sebagai berikut : -dA = k …………………………… persamaan 1 dt A – Ao = k.t dimana : A = konsentrasi pada saat t =t Ao= konsentrasi pada saat t = to k = konstanta laju reaksi t = umur simpan Dengan menggunakan persamaan Arrhenius, nilai k konstanta laju reaksi pada beberapa suhu penyimpanan dapat ditentukan. Persamaannya : k = ko.e -EaRT ……………………… persamaan 2 Dimana : ko = konstanta pre-eksponensial atau konstanta laju absolut k = konstanta laju reaksi pada suhu T Ea = Energi aktivasi Jmol R = konstanta gas ideal 8.314 JK.mol T = suhu absolut °K

2. PENELITIAN BAGIAN II : UJI STABILITAS IODIUM, ZAT BESI,

VITAMIN A Pada penelitian bagian kedua dilakukan pengamatan perubahan nilai gizi iodium I, zat besi Fe dan vitamin A yang difortifikasikan pada produk kecap dan saus cabe selama penyimpanan. Selanjutnya dilihat pola kestabilan zat-zat gizi tersebut. Bagan alir penelitian bagian kedua dapat dilihat pada Gambar 5. 25 Gambar 5 Bagan alir penelitian bagian II Produk kecap dan saus cabe disimpan dalam inkubator pada suhu 27°C. Selanjutnya dilakukan pengukuran kandungan iodium, zat besi dan vitamin A pada masing- masing suhu penyimpanan, pada hari ke-0, 14, 28, 42, 56. Data hasil pengamatan digunakan untuk menduga pola stabilitas masing- masing zat gizi tersebut dalam produk kecap dan saus cabe. Kandungan iodium diukur dengan menggunakan metode spektrofotometri, zat besi dengan AAS, sedangkan vitamin A dengan HPLC. Prosedur pengukuran kandungan iodium, zat besi dan vitamin A masing- masing dapat dilihat pada Lampiran 1, Lampiran 2 dan Lampiran 3

3. PENELITIAN BAGIAN III : UJI BIOLOGIS TERHADAP INDUK

TIKUS Pada penelitian bagian ketiga dilakukan pengujian nilai biologi I, Fe dan vitamin A dari produk kecap dan saus cabe menggunakan hewan coba tikus induk berdasarkan penilaian biokimia darah. Serta dilakukan PROD U K Kecap Saus cabe PEN YI M PAN AN Suhu : 27°C PEN GUJI AN KAN D UN GAN ZAT GI ZI I ODI UM , BESI , VI T. A Periode penguj ian : hari ke- 0, 14, 28, 42, 56 PEN D UGAAN POLA STABI LI TAS ZAT GI ZI I ODI UM , BESI , VI T. A 26 pengujian manfaat iodium pada kedua produk tersebut dalam mempengaruhi kemampuan belajar tikus percobaan. Bagan alir selengkapnya dari penelitian tahap ketiga ini dapat dilihat pada Gambar 6. Gambar 6 Bagan alir penelitian bagian III PENGELOMPOKAN TIKUS PERCOBAAN Tikus Betina umur sapih 21 hari, dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan yaitu : 1. Tidak diberi sumber I dan Fe dari ransum, tidak diberi kecap dan saus cabe kontrol - 2. Diberi sumber I dan Fe dari ransum, tidak diberi kecap dan saus cabe normal 3. Tidak diberi sumber I dan Fe dari ransum, diberi kecap 4. Tidak diberi sumber I dan Fe dari ransum, diberi saus cabe 5. Tidak diberi sumber I dan Fe dari ransum, diberi KIO 3 Keterangan : - Periode perlakuan 30 hari - Masing- masing perlakuan terdiri dari 8 tikus - Kecap dan saus cabe diberikan secara oral dengan dosis 1,8 gkg BBhari PENGAMATAN TIKUS PERCOBAAN A. PENIMBANGAN BERAT BADAN TIKUS Penimbangan berat badan terhadap masing- masing kelompok perlakuan setiap 2 hari sekali selama 30 hari

B. PENGAMATAN KEMAMPUAN BELAJAR

Setelah 30 hari perlakuan, dilakukan pengukuran kemampuan belajar tikus percobaan dengan menggunakan tes mendapatkan makanan food retrieval test Suprijana, 1992 PEMBEDAHAN TIKUS § 2 tikus untuk masing-masing perlakuan § Pengamatan : 1. ? sel neuron otak 2. Hb serum 3. Retinol serum TIKUS DIKAWINKAN § 5 tikus untuk masing- masing perlakuan TIKUS HAMIL Pengamatan : § Penimbangan BB tikus selama kehamilan 27

a. Pengujian Biokimia Darah

1. Pengambilan Darah § Darah diambil dari vena tikus, dimasukkan ke dalam 2 tabung, yaitu : 1 Tabung tanpa EDTA, 2 Tabung berisi EDTA 10. Dimasukkan ice box untuk dianalisis di laboratorium. § Darah dalam tabung 1 disentrifuse 3000 rpm, 10 menit. Bagian serum dipisahkan dan dimasukkan ke dalam ampul serum. Serum digunakan untuk analisis kandungan retinol. § Darah dalam tabung 2 siap dianalisis kandungan Hb-nya. 2. Pemeriksaan Hb Serum Lampiran 4 3. Pemeriksaan Retinol vitamin A Serum Lampiran 3

b. Pengamatan Kemampuan Belajar

Pengukuran kemampuan belajar tikus percobaan dilakukan dengan menggunakan tes mendapatkan makanan food retrieval test dengan menggunakan alat labirin pengujian kemampuan belajar tikus. Alat pengujian kemampuan belajar tikus dibuat dari kayu dengan ukuran 120 cm x 60 cm x 15 cm Gambar 7. Bagian dalam kotak diberi banyak penyekat. Penyekat ruangan dimaksudkan untuk membingungkan tikus, sehingga untuk memperoleh makanan ia harus mencari jalan yang paling mudah. Gambar 7 Alat pengujian kemampuan belajar tikus Prinsip tes ini adalah mengukur waktu yang diperlukan tikus yang diletakkan pada posisi Start S untuk mendapatkan makanan yang diletakkan pada posisi Finish F. Pengukuran kemampuan 28 belajar dilakukan pada tikus dewasa berumur 60 hari dan anak tikus berumur 30 hari. Beberapa hari sebelum pengujian, tikus dilatih dari posisi S dan dibimbing melalui lintasan untuk mencapai posisi F. Latihan dilakukan beberapa kali dengan frekuensi yang sama untuk masing- masing perlakuan. Pada saat pengujian, tikus diletakkan pada posisi S dan waktu yang dibutuhkan untuk mencapai posisi F dicatat dalam detik.

c. Analisis Jumlah Sel Neuron

Satu hari setelah pengukuran terakhir kemampuan belajar, tikus dibedah untuk dianalisis histologi otak dan dilakukan penghitungan jumlah sel neuronnya. Bagian otak yang diamati yaitu serebri otak kiri bagian tengah. Untuk anak tikus pengambilan organ otak dilakukan pada saat tikus berumur 4 hari dan 30 hari setelah uji kemampuan belajar. Sebelum dilakukan pembedahan terlebih dahulu tikus dimatikan dengan cara menarik bagian kepala dan ekor hingga ruas- ruas tulang belakangnya putus. Setelah itu dilakukan pembedahan kepala untuk mengambil otaknya. Otak difiksasi dengan larutan bouin asam pikrat jenuh : formalin : asam asetat = 15 : 5 : 1 selama 24 jam. Setelah itu otak direndam dalam alkohol 70, kemudian dipotong kecil-kecil dan dimasukkan ke dalam keranjang serta diberi label sebelum proses dehidrasi. Proses dehidrasi sampel jaringan dengan mencelupkan ke dalam alkohol 70. Penyimpanan dalam alkohol 70 dapat dilakukan dalam waktu yang lama dan dapat berfungsi sebagai stopping point. Proses dehidrasi selanjutnya adalah perendaman jaringan dalam alkohol 80, 90 dan 95 masing- masing selama 24 jam serta perendaman dalam alkohol absolut I, II, III masing- masing selama 1 jam. Tahap selanjutnya yaitu proses penjernihan atau clearing dengan memasukkan jaringan ke dalam xylol I, xylol II dan xylol III masing- masing selama 1 jam. Perlakuan pada xylol III dibagi dalam 29 dua tempat yaitu 30 menit di suhu ruang dan 30 menit di inkubator suhu 62°C untuk preadaptasi. Setelah proses penjernihan, dilakukan infiltrasi pada jaringan dengan mencelupkannya dalam parafin I, parafin II dan parafin III pada suhu 62°C masing- masing selama 1 jam. Otak yang telah didehidrasi diblok dengan parafin sampai memadat embedding. Proses embedding dilakukan dengan alat tisue embedding console. Setelah padat dilakukan pemotongan otak dengan ukuran 5 mikron berbentuk pita dengan alat mikrotom. Pita yang dihasilkan diapungkan dalam air dingin dan diseleksi untuk mendapat sayatan yang baik. Sayatan yang baik diapungkan di permukaan air hangat 40°C kemudian dipindahkan pada gelas objek lalu diperiksa di bawah mikroskop. Objek gelas tersebut diletakkan diatas hot plate selama 10- 15 menit. Kemudian jaringan dimasukkan dalam inkubator 40°C sela ma satu malam sebelum pewarnaan. Pewarnaan preparat dilakukan dengan menggunakan dua pewarna yaitu Hematoksilin- Eosin HE. Sebelumnya dilakukan deparafinisasi dengan mencelupkan jaringan dalam xylol III, xylol II, xylol I maing- masing 3-5 menit. Kemudian rehidrasi dengan merendam jaringan dalam alkohol absolut III, II, I, alkohol 95, 90, 80, 70 masing- masing selama 3-5 menit. Selanjutnya dicuci dengan akuades selama 15-30 menit, perendaman dalam akuades 5 menit. Pencucian dengan air kran dilakukan kembali selama 15-30 menit, perendaman dalam akuades 5 menit lalu pewarnaan dengan Eosin alkohol selama 1-2 menit dan dicuci lagi dengan akuades. Selanjutnya dilakukan dehidrasi dengan merendam jaringan dalam alkohol 70, 80, 90, absolut I, II dan III serta xylol I, II, III. Preparat kemudian ditutup dengan gelas penutup dan siap untuk diobservasi dengan mikroskop dan selanjutnya dilakukan pemotretan. Analisis terhadap histologi otak dilakukan dengan menggunakan mikroskop yang dilengkapi dengan kamera. Jumlah sel neuron dihitung per lapang pandang dengan pembesaran 200 kali pada 30 tikus umur 60 hari dan anak tikus umur 30 hari, sedangkan pada anak tikus umur 4 hari dengan pembesaran 400 kali.

4. PENELITIAN BAGIAN IV : UJI BIOLOGIS TERHADAP ANAK

TIKUS Pada penelitian bagian keempat ini Gambar 8, dilakukan pengamatan terhadap jumlah anak tikus yang dilahirkan serta berat lahir anak tikus. Anak tikus diperoleh dari hasil perkawinan induk masing- masing perlakuan. Anak tikus selanjutnya mendapat perlakuan yang sama seperti induknya. Jadi dalam hal ini, ada 5 kelompok perlakuan anak tikus. Pengamatan kemampuan belajar dan analisis jumlah sel neuron otak menggunakan metode yang sama dengan metode pada penelitian bagian ketiga. Pengamatan tambahan terhadap anak tikus yaitu: penimbangan berat otak. Gambar 8 Bagan alir penelitian bagian IV ANAK TIKUS Pengamatan : 1. penimbangan BB lahir tikus umur 4 hari 2. penimbangan BB anak tikus 2 hari sekali selama 30 hari 3. pengamatan kemampuan belajar anak tikus umur 30 hari PEMBEDAHAN ANAK TIKUS umur 30 hari Pengamatan : 1. Berat otak tikus 2. ? sel neuron otak TIKUS MELAHIRKAN Pengamatan : § penghitungan ? anak PEMBEDAHAN ANAK TIKUS umur 1 hari Pengamatan : § ? sel neuron otak 31 Prosedur Pengukuran Berat Pengukuran berat otak dilakukan pada anak tikus umur 30 hari. Berat otak diukur dengan menggunakan neraca analitik.

D. RANCANGAN PERCOBAAN