28
III METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan selama 6 bulan mulai bulan April sampai September 2008. Udang yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Tambak udang
Pinang Gading, Bakauheni Lampung Selatan. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas
Perikanan, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Pelaksanaan Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam 2 tahap yaitu : 1. Seleksi isolat bakteri probiotik yang mampu meningkatkan sistem imun 2. Uji kerentanan udang yang
diberi bakteri probiotik terpilih terhadap infeksi patogen.
3.2.1 Seleksi Bakteri Probiotik yang Mampu Meningkatkan Sistem Imun
Pada uji ini digunakan isolat bakteri probiotik 1 Vibrio alginolyticus 13G1 2 V. alginolyticus SKT-b 3 Vibrio sp.13B 4 Vibrio sp. 8A
5 Pseudoalteromonas 1ub 6 Bacillus sp. dan kontrol larutan fisiologis. Udang yang digunakan dalam penelitian ini berjumlah 15 ekor ukuran
9±0,6 g untuk setiap perlakuan dengan 3 ulangan. Udang dipelihara didalam akuarium yang berisi air laut 40 l dan diberi pakan komersial selama periode
penelitian sebanyak 5 kali sehari yaitu pada jam 06.00, 10.00, 14.00, 18.00 dan 21.00. Pengujian dilakukan dengan menyuntikkan bakteri probiotik pada udang
setiap perlakuan dengan kepadatan 10
6
CFUekor. Sedangkan untuk perlakuan kontrol udang disuntik dengan larutan fisiologis. Pengambilan hemolim dilakukan
pada saat 24 jam setelah pemberian bakteri probiotik kemudian dilakukan pengukuran parameter sistem imun untuk setiap perlakuan dan ulangan.
29
3.2.2 Uji Kerentanan Udang yang diberi Bakteri Probiotik terpilih terhadap Infeksi Patogen
Pada percobaan kedua ini tiga isolat yang menunjukkan respon imun terbaik digunakan. Udang yang digunakan dalam penelitian ini berjumlah 15 ekor ukuran
9±0,6 g untuk setiap perlakuan dengan 3 ulangan. Udang dipelihara didalam akuarium yang berisi air laut 40 l dan diberi pakan komersial selama periode
penelitian sebanyak 5 kali sehari yaitu pada jam 06.00, 10.00, 14.00, 18.00 dan 21.00. Pengujian dilakukan dengan menyuntikkan tiga isolat bakteri probiotik
hasil percobaan I sebanyak 10
6
CFUekor. Sedangkan untuk perlakuan kontrol udang disuntik dengan larutan fisiologis. Penyuntikkan dilakukan pada hari
pertama dan pada hari kesepuluh diuji tantang dengan bakteri V. harveyi MR5399. Hemolim dari udang dikumpulkan setiap dua hari mulai pada hari kesepuluh
hingga hari ke-16 dari setiap perlakuan dan ulangan dan pengukuran parameter sistem imun.
THC, DHC, AP, PO Masa pemeliharaan
0 2 4 6
10 16 hari
SR - Bakteri probiotik Uji tantang
- Larutan fisiologis V. harveyi 10
6
injeksi ke udang Keterangan : THC : total hemosit count
DHC : differensial hemosit count AP : aktifitas phagositosis
PO : aktifitas phenoloksidase
SR : kelangsungan hidup
Gambar 1. Skema pengujian kerentanan udang yang diberi bakteri probiotik terpilih terhadap infeksi patogen.
Pengambilan hemolim
30
3.3 Pengukuran Parameter
3.3.1 Sistem Imun
Paramater imun yang diukur adalah Total Hemosit THC, Differensial Hemosit Count DHC, Aktifitas Phenoloksidase PO dan Aktifitas Phagositosis
AP. a.
Total Hemosit THC Blaxhall dan Daishley 1973
Hemolim diambil sebanyak 0,1 ml dibagian pangkal kaki jalan ke 5 dengan syringe 1 ml yang sudah berisi antikoagulan Na-sitrat sebanyak 0,3 ml untuk
mencegah terjadinya penggumpalan hemosit, kemudian dihomogenkan selama 5 menit. Tetesan pertama hemolim pada srynge dibuang, selanjutnya hemolim
diteteskan ke haemositometer dan dihitung jumlah selnya per ml dibawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 40 kali. Total hemosit count dihitung
dengan menggunakan rumus:
1000 1
X FP
X besar
kotak volume
X terhitung
sel rata
rata Hemosit
Total ∑
− =
Keterangan : FP = faktor pengenceran
b. Diferensial Hemosit Count DHC Martin dan Graves 1995
Hemolim yang telah diambil dari udang uji diteteskan pada gelas objek dan dibuat ulasan, kemudian dikeringkan di udara dan difiksasi dengan methanol
100 selama 5 menit. Setelah itu dikeringkan di udara kembali dan diwarnai dengan cara direndam dilarutan giemsa 10 selama 10 menit dikeringkan di
udara, dicuci dalam air mengalir selama 30 detik dan dibiarkan kering. Preparat diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 100 kali dan
dibedakan menurut jenisnya yaitu sel hialin, semi granular dan granular. Persentase jenis sel hemosit dihitung dengan menggunakan rumus:
100 X
hemosit Total
hemosit sel
jenis tiap
Jumlah hemosit
sel jenis
Persentase =
31
c. Aktifitas Phenoloksidase PO Liu and Chen 2004
Aktifitas phenoloksidase diukur menggunakan spektrofotometer. Pengamatan dilakukan dengan melihat perekaman pembentukan dopachrome
yang dihasilkan dari
L
-dihydroxyphenylalanine
L
-DOPA menggunakan metode yang dijelaskan oleh Liu and Chen 2004. Hemolim disentrifuse pada 700 x g
pada 4
o
C selama 20 menit. Cairan supernatant dibuang dan pellet dibilas, masukkan kedalam 1 ml cacodylate-citrate buffer sodium cacodylate 0,01 M,
sodium chloride 0,45 M, trisodium citrate 0,10 M, pH 7,0 kemudian disentrifuse ulang. Pellet ditambahkan dengan 200
μl cacodylate buffer sodium cacodylate 0,01 M, sodium chloride 0,45 M, calcium chloride 0,01 M, magnesium chloride
0,26 M, pH 7,0. Larutan kemudian dibagi dua. Larutan pertama sebanyak 100 μl
diinkubasi selama 10 menit pada 25
o
C dengan 50 μl trypsin 1 mg ml
-1
, sebagai elicitor. Kemudian tambahkan 50
μl
L
-DOPA, dan 5 menit kemudian tambahkan 800
μl cacodylate buffer. Larutan kedua sebanyak 100 μl suspension sel ditambahkan dengan 50
μl cacodylate buffer untuk menggantikan trypsin dan 50 μl
L
-DOPA dan digunakan sebagai kontrol untuk background phenoloksidase activity pada semua kondisi uji. Kerapatan optik pada 490 nm diukur
menggunakan spektrofotometer.
d. Aktifitas Phagositosis Anderson and Siwicki 1993
Kategori