Identifikasi Bakteri Uji Peningkatan Virulensi Bakteri Uji

4

II. METODOLOGI

2.1 Metode Penelitian

Penelitian ini terdiri dari dua uji utama yaitu uji in vitro dan uji in vivo. Identifikasi dan peningkatan virulensi bakteri uji, penentuan nilai LD 50 Lethal Dosage 50 serta pembuatan ekstrak meniran-bawang putih yang dilakukan sebelum uji in vitro dimulai. Selanjutnya pembuatan pakan perlakuan, persiapan wadah dan ikan uji dilakukan sebelum uji in vivo dimulai.

2.1.1 Identifikasi Bakteri Uji

Bakteri yang digunakan pada penelitian ini berasal dari isolat bakteri yang diperoleh dari Balai Budidaya Air Payau Situbondo, Jawa Timur yang diketahui sebagai Vibrio alginolyticus. Isolat bakteri dibiakkan kembali pada agar miring SWC sea water complete lalu diinkubasi pada suhu 28 °C selama 24 jam untuk diidentifikasi ulang di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Identifikasi ulang dilakukan untuk memastikan tidak adanya kontaminan pada isolat bakteri yang meliputi uji karakterisasi fisiologi dan biokimia bakteri yang terdiri dari pewarnaan Gram, uji oksidatiffermentatif, uji motilitas, uji katalase dan uji oksidase Holt et.al, 1994. Setelah hasil uji isolat bakteri menunjukkan karakter fisiologi dan biokimia yang sama dengan V. alginolyticus Lampiran 1, dilakukan peremajaan bakteri ke agar miring SWC dari stok sebelumnya.

2.1.2 Peningkatan Virulensi Bakteri Uji

Bakteri yang telah teridentifikasi pada tahap sebelumnya ditingkatkan virulensinya melalui uji postulat Koch sebelum digunakan pada uji tantang. Sebanyak satu ose bakteri diambil dari biakan terbaru berumur 24-48 jam dan diinokulasikan ke dalam erlenmeyer yang berisi 25 ml media SWC cair, kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 28 o C pada inkubator bergoyang waterbath shaker dengan kecepatan 150 rpm. Setelah itu diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan pipet mikro dan dimasukkan ke dalam mikrotube, disentrifuse sekitar 5 menit dan dibuang supernatannya. Endapan yang diperoleh 5 dicuci dengan 1 ml PBS phosphate buffer saline lalu divortex dan disentrifuse kembali dan buang supernatannya dilakukan sebanyak 2 kali. Setelah itu 1 ml PBS dicampurkan kembali dengan endapan yang sudah dicuci selanjutnya divortex dan diambil 0.2 ml untuk diinjeksikan secara intraperitoneal diantara sirip ventral dan anal pada satu ekor ikan kerapu macan untuk menguji virulensinya. Setelah ikan menunjukkan gejala klinis seperti hemoragi pada rahang mulut atau sirip yang kemerahan, ikan dibedah dan dilakukan reisolasi bakteri dengan menggoreskan jarum ose steril ke bagian ginjal, empedu, limpa, usus dan organ lainnya yang menunjukkan kelainan kemudian dibiakkan di media TCBS Thiosulphate Citrate Bile-salt Sucrose dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28 o C. Untuk mendapatkan biakan murni maka setiap koloni bakteri yang tumbuh terpisah dan berlainan morfologinya dibiakkan kembali ke dalam agar miring SWC dan diinkubasi pada suhu 28 o C selama 24 jam selanjutnya diidentifikasi kembali yang meliputi uji oksidatiffermentatif, uji oksidase, uji katalase, uji motilitas dan pewarnaan Gram Holt et.al, 1994 untuk memastikan kelainan yang terjadi pada organ-organ tersebut disebabkan oleh bakteri yang dinjeksikan. Bakteri hasil uji postulat Koch inilah yang akan digunakan pada uji selanjutnya.

2.1.3 Penentuan Nilai LD