direndam dalam larutan HgCl 0,5 selama 2 menit lalu dibilas 3 kali dengan akuades steril. Selanjutnya, dipindahkan pada cawan petri steril.
3.4.3 Pembuatan Media
Kombinasi media yang digunakan yaitu 1 ppm 2,4 - D dan 1 ppm kinetin. Menurut penelitian Sutini et al. 2009, kombinasi media 2,4 - D 1 ppm dan kinetin 1 ppm
merupakan media yang paling baik untuk pertumbuhan kalus teh Camellia sinensis L. dan memproduksi katekin paling tinggi.
Tahap awal pembuatan media dalah pembuatan larutan stok, yang terdiri dari stok hara mikro iron, mio-inositol vitamin dan zat pengatur tumbuh. Sementara
sukrosa dan agar-agar ditimbang langsung sesuai kebutuhan tanpa harus dijadikan larutan stok.
Pembuatan larutan Murashige dan Skoog diawali dengan cara hara makro, iron, vitamin, sukrosa dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang ditambahkan akuades
hingga 500 mL kemudian ditambahkan akuades hingga 1000 mL. Selanjutnya dimasukkan 2,4 - D dan kinetin. Kemudian diukur derajat keasaman pH yang
diukur setiap perlakuan dengan menggunakan pH meter 5,8. Untuk mendapatkan pH yang optimum maka bisa ditambahkan NaOH 0,1 N atau HCl 0,1 N.
Pada setiap media 1000 mL ditambahkan 7 g agar-agar dan gula 3 g sambil dimasak sampai mendidih. Media dimasukkan ke dalam botol-botol kultur, mulut
botol kultur ditutup alumunium foil, ditutup dengan plastik kemudian diikat dengan karet. Kemudian botol-botol itu disterilkan dengan autoklaf pada tekanan 15 psi,
pada suhu 121
°C
selama 30 menit, setelah selesai kemudian disimpan di rak kultur dengan suhu 25
°C
selama 4 hari setelah itu media siap dipakai.
3.4.4 Penanaman Eksplan
Sebelum melakukan penanaman diusahakan agar ruangan dalam keadaan bersih. Penanaman dilakukan di dalam Laminar Air Flow LAF
yang telah disterilkan dengan UV. Setelah itu dipersiapkan alat-alat diseksi yang telah steril,
lampu bunsen, mancis dan alkohol 70 dan sebelum penanaman eksplan tangan dibersihkan dengan menggunakan hand wash setelah itu alkohol 70. Alat-alat
diseksi berupa pinset dan pisau direndam pada alkohol 70 dan dibakar di atas
Universitas Sumatera Utara
bunsen agar lebih steril. Pucuk daun teh yang telah steril dihilangkan tulang dan tepi daun, kemudian dipotong-potong dengan ukuran 2 cm untuk induksi kalus.
Potongan ditanam sebanyak 1 eksplan per botol kultur. Setelah botol diisi eksplan botol kemudian ditutup dengan menggunakan aluminium foil, plastik dan diikat
dengan karet. Botol kultur di inkubasi di ruang dengan suhu 25
°
C dan disusun sesuai dengan layout perlakuan dan ditutup dengan kain hitam.
3.4.5 Pemeliharaan Eksplan
Botol-botol yang berisi eksplan disusun pada rak kultur sesuai dengan layout penelitian. Intensitas cahaya yang digunakan pada rak kultur adalah dengan
menggunakan lampu neon 500 lux, suhu ± 25
°
C, ditutup dengan kain berwarna hitam dan disemprot alkohol 70 setiap hari.
3.4.6 Pemberian Elisitor Sinar Ultraviolet UV C
Setelah kalus tumbuh, dilakukan sub-kultur sebulan sekali sebanyak 2 kali. Perlakuan elisitor sinar UV C dengan 4 lama penyinaran 0 Kontrol, 15, 30 dan
45 menit yang diaplikasikan pada saat kalus berumur 4 minggu setelah sub kultur ke-2.
3.4.7 Analisis Kandungan Katekin
Untuk menganalisis kandungan katekin pada Camellia sinensis L. Dilakukan dengan cara sebagai berikut:
1. Ekstraksi Kalus Dengan cara kalus ditimbang 250 mg dihaluskan menggunakan mortal dan
alu dan ditambah 10 mL aquabides panas temperatur 70-80
°
C, didiamkan selama ± 10 menit. Setelah dingin disaring, lalu dimasukan ke dalam labu ukur 25,0 mL.
Ampas kalus teh dibilas dengan 10 mL air panas sebanyak 2 kali, didiamkan ± 10 menit kemudian disaring. Hasil ekstrak kedua dan ketiga dikumpulkan pada labu
ukur yang sama. Larutan ekstrak teh, diambil 12,5 mL kemudian ditambahkan 25 mL kloroform dikocok pelan dalam corong pisah maka akan terbentuk fase air
yang terdiri dari 2 lapisan. Lapisan bawah bersifat non-polar dan lapisan atas bersifat polar. Ditampung lapisan atas kemudian diambil sebanyak 12,5 mL
Universitas Sumatera Utara
kemudian diekstraksi dengan 12,5 mL etil asetat terbentuk fase etil asetat yang terdiri dari 2 lapisan yang diambil adalah lapisan bawah lakukan sebanyak 3 kali
kemudian ditampung ekstrak katekin lalu dirotari evaporator dengan kecepatan 280 rpm dan suhu 75
°
C sampai terbentuk kerak atau endapan katekin. Setelah itu dinginkan dan larutkan menggunakan ethanol sampai volumenya 5 mL disaring
menggunakan kertas saring Whatmann 0,2 µm dan masukkan ke dalam botol pial Lampiran 1. Gambar b. Halaman 31 Harbone 1987 dimodifikasi oleh Sutini
2008. 2. Analisis katekin dengan HPLC High Performance Liquid Chromatography
Untuk mengetahui kandungan katekin pada kalus teh terlebih dahulu diatur kondisi operasional HPLC berupa temperatur 30ºC-40 °C, panjang gelombang 275
nm, fase gerak terdiri dari ethanol: aquabides: etil asetat = 20:75:5, laju alir fase gerak 1 mL menit, kolom yang digunakan adalah C18 dan detektor yang
digunakan adalah UV Vis Shimadzu. Dibuat larutan standar katekin dengan berbagai macam konsentrasi dengan kadar 250, 500, 750 dan 1000 ppm, kemudian
masing-masing konsentrasi disuntikkan sebanyak 100 μL pada instrumen HPLC
dengan kondisi operasional yang sudah di seting.. maka akan didapat kromatog dengan retention time tR. Setelah itu diidentifikasi dengan cara membandingkan
retention time larutan standar katekin dengan ekstrak kalus katekin Jhonson et al., 1978 dimodifikasi oleh Sutini 2008.
3.5 Parameter yang Diamati
