34
reaksi rantai karena template DNA diperbanyak secara eksponensial di setiap siklusnya WHO, 2011.
Metode PCR telah dimodifikasi dan digunakan di berbagai bidang ilmu. Setiap pemeriksaan bakteri atau virus dengan menggunakan PCR memiliki
protokol tersendiri, protokol ini berisi prosedur dalam melakukan reaksi dan parameter yang perlu diatur pada sampel suhu, jumlah dan jenis reagen serta
durasi suhu. Real-time PCR merupakan modifikasi terbaru yang menggabungkan deteksi
fluoresence dengan metode PCR konvensional. Real-time PCR memungkinkan deteksi dan penghitungan jumlah molekul dari target DNA yang
telah dihasilkan. Modifikasi ini telah diterima secara luas karena risiko kontaminasinya yang rendah; serta memiliki sensitivitas dan kecepatan proses
yang tinggi. Oleh karena itu Real-time PCR diakui sebagai gold standar untuk diagnosis beberapa penyakit yang disebabkan oleh bakteri, virus dan menghitung
jumlah virus pada sampel klinis Wicaksono, 2015.
1. Tiga Tahap Proses Penggandaan DNA
Proses sintesis dan penggandaan DNA menggunakan PCR terdiri dari 3 tahap Penunjukan Gambar 11, yaitu : denaturasi, annealing dan eexstensi. Setiap
tahap tersebut diatur pada kondisi suhu yang berbeda. Berikut ini adalah 3 tahap tersebut Lo et al., 2006; PCR Virtual Lab, 2012 :
a Tahap denaturasi, merupakan tahap pemisahan sebuah untai ganda DNA agar
terpisah menjadi 2 buah untai tunggal DNA yang dilakukan pada suhu 94
o
C. b
Tahap annealing penempelan, merupakan tahap awal sintesis DNA secara in vitro. Suhu dan waktu yang diperlukan untuk proses annealing tergantung
35
dari komposisi dan panjang basa serta konsentrasi primer. Umumnya, untuk primer dengan panjang 18 – 30 pasang basa digunakan suhu 55
o
C selama 1 – 2 menit. Turunnya suhu menjadi 55
o
C mengakibatkan untai tunggal DNA cenderung akan bergabung dengan untai tunggal yang lain tetapi karena
adanya primer, untai tunggal DNA tersebut dihambat untuk berpasangan kembali.
c Tahap ekstensi pemanjangan, biasanya dilakukan pada suhu 72
o
C. Tahap ini merupakan proses pemanjangan primer oleh DNA polymerase. Enzim ini
menjadi aktif karena adanya perubahan suhu menjadi 72
o
C.
Gambar 11. Prinsip kerja Polymerase Chain Reaction : 1 Denaturasi : reaksi dipanaskan
sampai 94-98 °C selama 20-30 detik untuk memutus ikatan hidrogen di antara untai; 2 Annealing: suhu reaksi diturunkan menjadi 50-65 °C selama
20-40 detik untuk memungkinkan primer menempel ke untai Template; 3 Pemanjangan : suhu ditingkatkan suhu optimal tergantung pada DNA
Polymerase yang digunakan misalnya 72-78 °C untuk Taq Polymerase untuk memungkinkan penambahan dNTP. Jumlah urutan target ganda dengan
setiap siklus termal yang mengarah ke amplifikasi eksponensial diwakili oleh 2 siklus Applied Biological Materials Inc, 2016.
36
Tiga tahap tersebut siklus replikasi dilakukan berulang-ulang sampai mendapatkan hasil yang diinginkan. Dengan menggunakan perhitungan
sederhana, jumlah penggandaan yang dihasilkan adalah 2
n
, dengan n adalah jumlah siklus replikasi yang dilakukan Principle of the PCR, 1999. Jumlah
siklus yang optimum tergantung pada konsentrasi awal template DNA, biasanya adalah 25 – 35 siklus. Siklus yang terlalu sedikit akan memberikan hasil yang
sedikit, sebaliknya bila terlalu banyak akan meningkatkan jumlah dan kompleksitas produk non-spesifik, sehingga menimbulkan efek
plateau Sulistyaningsih, 2007.
2. Prinsip Kerja Mesin PCR
