Zona bening tidak tampak sama sekali pada sumur yang diberikan substansi N dan E yang ditanam pada tiap bakteri uji Gambar 7. Hal ini menunjukkan
bahwa aktivitas antibakteri hanya terdeteksi pada substansi yang kondisi asamnya dipertahankan A.
Theron dan Lues 2011 menyampaikan bahwa bakteri asam laktat menghasilkan senyawa sekunder yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri
lain disekitarnya. Zat asam organik yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat dapat menurunkan pH media dan menghambat pertumbuhan bakteri. Selain itu zat lain
yang diproduksi oleh bakteri asam laktat seperti peroksida, diasetil, dan senyawa protein seperti bakteriosin diketahui dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain
disekitarnya. Perlakuan berbeda yang diaplikasikan pada ketiga supernatan isolat NS9
bertujuan untuk mengidentifikasi jenis antibakteri yang dihasilkan oleh isolat NS9. Supernatan yang tidak diberi perlakuan sama sekali kode A bertujuan
untuk mempertahankan kondisi asam dan mengidentifikasi zat antibakteri yang bersifat asam. Perlakuan penetralan pada supernatan kode N bertujuan untuk
menghilangkan efek antibakteri yang bersifat asam, sehingga hanya zat antibakteri yang bersifat non-asam saja yang bekerja menghambat pertumbuhan bakteri lain.
Perlakuan pengendapan protein pada supernatan kode E bertujuan untuk mengendapkan protein dari supernatan dan mengetahui aktivitas antibakteri dari
protein tersebut. Hasil dari percobaan ini menunjukkan bahwa aktivitas antibakteri yang dihasilkan dari supernatan isolat NS9 hanya terlihat pada supernatan yang
diberi kode A. Berdasarkan hasil ini dapat disimpulkan bahwa isolat NS9 tidak memproduksi antibakteri yang termasuk ke dalam jenis protein seperti bakteriosin
pada pengendapan amonium sulfat 50. Antibakteri yang dihasilkan oleh isolat NS9 termasuk ke dalam jenis asam organik.
4.3 Penentuan Waktu Optimum Produksi Antibakteri
Pengukuran waktu optimum produksi antibakteri bertujuan untuk mengetahui waktu optimum produksi antibakteri yang dihasilkan dari isolat
NS9. Kultur isolat NS9 yang ditumbuhkan dalam media produksi antibakteri
diamati setiap 3 jam selama 24 jam menunjukkan adanya pola perubahan pH, produksi protein dan asam laktat Lampiran 1.
4.3.1 Pertumbuhan isolat dan perubahan pH Pertumbuhan isolat bakteri NS9 diukur dengan cara menginkubasikan
bakteri isolat pada media MRSB selama 24 jam. Pengukuran dilakukan setiap tiga jam sekali. Pengukuran yang dilakukan meliputi pengukuran nilai absorbansi
media pada panjang gelombang 660 nm serta pengukuran nilai pH. Hasil pengukuran nilai absorbansi untuk optical density OD dan nilai pH setiap tiga
jam selama 24 jam dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 8 Grafik nilai Optical Density OD , dan pH
bakteri isolat NS9 selama fase produksi 24 jam.
Fase pertumbuhan yang berbeda-beda terlihat selama 24 jam inkubasi dari isolat NS9 Gambar 8. Pertumbuhan isolat mulai terjadi pada jam ke-0 hingga
jam ke-15. Fase ini disebut dengan fase eksponensial fase log. Cohen 2011 menyatakan bahwa fase eksponensial terjadi karena konsumsi nutrisi dalam media
oleh kultur. Hal tersebut mengakibatkan kultur berkembang pada growth rate yang konstan, dimana growth rate proporsional terhadap nilai OD. Pommerville
2011 menyatakan fase log terjadi ketika semua sel dalam kultur mengalami pembelahan biner. Setiap generasi yang dilalui, jumlah sel bertambah dua kali
lipat dan grafik meningkat dalam bentuk garis lurus atau grafik logaritmik.
0.00 1.00
2.00 3.00
4.00 5.00
6.00 7.00
3 6
9 12
15 18
21 24
O D
p H
Lama inkubasi jam
Pertumbuhan isolat melambat pada fase yang ditunjukkan pada jam ke-6 hingga jam ke-15. Pertumbuhan tersebut bertambah secara simultan, konstan,
dengan growth rate yang hampir mendekati nol. Cohen 2011 menyatakan bahwa hal tersebut terjadi karena nutrien yang hilang akibat konsumsi, medium yang
semakin asam, akumulasi toksik atau karena zat yang dapat menghambat pertumbuhan. Meskipun demikian, pertumbuhan masih tetap terjadi.
Kurva pertumbuhan mengalami kecenderungan stasioner pada jam ke-15 hingga jam ke-21. Cohen 2011 menyatakan bahwa kondisi nutrien yang hilang
akibat konsumsi, medium yang semakin asam, akumulasi toksik atau karena zat yang dapat menghambat pertumbuhan menyebabkan pertumbuhan semakin
menurun sehingga level pertumbuhan akan mendekati nol dan penambahan jumlah sel tidak ada.
Penurunan grafik OD pada jam ke-21 hingga jam ke-24 menunjukkan bahwa isolat NS9 memasuki fase kematian decline phase. Pommerville 2011
menyatakan bahwa hal ini terjadi karena nutrien dalam media yang tersisa terbatas atau jumlahnya menjadi jauh lebih rendah.
Kecenderungan penurunan nilai pH mulai dari waktu inkubasi awal pada jam ke-0 hingga jam ke-12 Gambar 8. Nilai pH pada jam ke-12 hingga jam ke-
24 sudah menunjukkan kestabilan dimana nilai pH tetap tidak berubah hingga akhir masa inkubasi, yaitu 4.
Hubungan yang terlihat antara nilai absorbansi dan nilai pH pada tahap ini adalah perbandingan terbalik. Ketika isolat NS9 pertama kali diinkubasi pada
jam ke-0, pH yang terlihat menunjukkan nilai yang tertinggi yaitu 6, sedangkan nilai absorbansi pada waktu awal inkubasi memiliki nilai terendah, yaitu 0,19.
Ketika kepadatan isolat bertambah ditandai dengan naiknya nilai OD hingga mencapai 6,48 pada jam ke-12, nilai pH yang ditunjukkan menurun dari 6 hingga
4. Nilai pH 4 ini merupakan nilai pH yang terendah dan tidak berubah hingga fase death yang ditunjukkan pada menurunnya nilai OD dari jam ke-21 hingga jam
ke-24. Hwang et al. 2011 menyatakan bahwa metabolit sekunder yang dihasilkan
oleh bakteri asam laktat seperti asam laktat dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti komposisi media sumber karbohidrat, konsentrasi gula, dan faktor
pertumbuhan, keberadaan oksigen, tingkat pH, dan konsentrasi metabolit sekunder dari produk. Fase eksponensial pada jam ke-0 hingga jam ke-15
menunjukkan peningkatan nilai OD, yang diakibatkan oleh kandungan media MRS broth yang kaya akan nutrisi pertumbuhan bakteri asam laktat seperti pepton
dan glukosa. Adanya glukosa memacu terjadinya proses fermentasi yang menghasilkan senyawa metabolit sekunder seperti asam laktat. Zat ini terus
diproduksi hingga konsentrasinya meninggi. Hwang et al. 2011 juga menyatakan bahwa konsentrasi asam laktat yang tinggi juga dapat memperlambat
pertumbuhan sel selama masa fermentasi. Oleh karena itu, semakin banyak asam laktat yang diproduksi selama masa fermentasi ditandai dengan penurunan nilai
pH pada grafik, maka pertumbuhan sel yang terjadi semakin lambat. Kondisi media yang semakin minim nutrisi akibat proses fermentasi yang terus menerus
mengakibatkan pertumbuhan sel berkurang dan mengakibatkan kematian sel pertumbuhan sel pada akhir masa inkubasi.
4.3.2 Kadar asam laktat Kadar asam laktat yang diproduksi ini erat kaitannya dengan
kemampuannya sebagai inhibitor bakteri patogen pada makanan. Pengukuran kadar asam laktat dari substansi antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri isolat
NS9 dilakukan dengan metode titrasi. Supernatan direaksikan dengan reagen fenoftalein sebagai indikator warna perubahan pH. Larutan dititrasi dengan NaOH
N = 0,1091 mol hingga larutan berubah menjadi warna merah. Hasil kadar asam laktat pada setiap tiga jam pengamatan selama 24 jam dapat dilihat pada Gambar
9.
Gambar 9 Grafik kadar asam laktat sampel supernatan bakteri isolat NS9.
0.5 1
1.5 2
2.5 3
3.5 4
4.5
3 6
9 12
15 18
21 24
k a
d a
r a
sa m
l a
k ta
t
Lama inkubasi jam
Perubahan konsentrasi asam laktat terjadi setiap tiga jam pengambilan sampel Gambar 9. Perubahan tersebut menunjukkan peningkatan mulai dari
awal produksi hingga akhir. Hal tersebut menunjukkan bahwa asam laktat diproduksi oleh bakteri isolat NS9 selama fase produksi 24 jam.
Kadar asam laktat yang terukur berhubungan dengan pH media dan pertumbuhan isolat. Ketika berada di awal fase pertumbuhan dimana pH media
tinggi, kadar asam laktat yang terukur sangat rendah. Bentuk kurva kadar asam laktat yang ditunjukkan pada Gambar 9 merupakan bentuk kurva log dimana pada
awal masa inkubasi, terjadi peningkatan yang cukup besar dan seiring dengan bertambahnya waktu, peningkatan tersebut tetap ada namun cenderung melambat
hingga mencapai kondisi statis. Penurunan produksi asam laktat ini erat kaitannya dengan fase pertumbuhan sel semakin menurun juga. Produksi asam laktat pada
fase tersebut tidak setinggi produksi pada awal masa pertumbuhan bakteri yaitu pada jam ke-0 hingga jam ke-15.
Asam laktat merupakan salah satu jenis asam organik yang diproduksi oleh bakteri asam laktat. Menurut Theron dan Lues 2011, asam laktat
merupakan salah satu metabolit utama dari bakteri asam laktat, namun pada bakteri heterofermentatif, bakteri asam laktat juga memproduksi asam asetat dan
sebagian asam propionat dalam jumlah besar. Asidifikasi pengasaman yang diakibatkan asam organik meningkatkan aktivitas antibakterial baik asam organik
maupun substansi inhibitor lain seperti bakteriosin. Asam laktat berperan dalam proses penghambatan bakteri lain. Theron dan
Lues 2011 menyatakan bahwa asam terdisosiasi menjadi ion hidrogen dan anion toksik yang mampu mengganggu fungsi fisiologis sel dan mendestabilasi protein
sel. Menurut Pelaez dan Orue 2010, asam laktat mampu melemahkan permeabilitas bakteri Gram negatif dengan merusak membran luar bakteri Gram
negatif. Asam laktat merupakan molekul yang larut dalam air sehingga mampu menembus ke dalam periplasma bakteri Gram negatif melalui protein porin pada
membran luarnya. Pelindung dari permeabilitas membran luar berupa lapisan lipopolisakarida yang terletak pada permukaan membran dirusak oleh asam laktat
sehingga substrat antibakteri yang lain yaitu diasetil, bakteriosin, hidrogen
peroksida dan lactoperidase system dapat berpenetrasi ke dalam membran sitoplasma.
4.3.3 Kadar protein Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode Bradford Nielsen
2010 Lampiran 2. Kadar protein supernatan per tiga jam selama 24 jam dapat dilihat pada Gambar 10.
Gambar 10 Kadar protein supernatan tiap 3 jam selama 24 jam. Perubahan konsentrasi protein terjadi setiap tiga jam selama 24 jam
Gambar 10. Namun perubahan kadar protein tidak menunjukkan adanya peningkatan yang besar. Oleh karena itu dari grafik ini dapat diambil simpulan
yang menguatkan bahwa protein tidak diproduksi dalam jumlah besar oleh bakteri isolat NS9 selama fase produksi.
Keberadaan kandungan protein pada supernatan isolat NS9 penting untuk diketahui untuk mengetahui adanya potensi senyawa antibakteri lain berjenis
protein seperti bakteriosin. Theron dan Lues 2011 menyatakan bahwa antibakteri berjenis peptida
juga disebut sebagai
bakteriosin, adalah zat penting
yang dihasilkan oleh bakteri asam
laktat. Bakteriosin adalah komponen antibakteri protein yang diproduksi dari berbagai jenis bakteri, namun tidak letal bagi bakteri
yang memproduksi bakteriosin tersebut. Bakteri asam laktat adalah varian yang paling penting dalam produksi
bakteriosin dan substansi mirip bakteriosin. Bakteriosin yang diproduksi oleh bakteri asam laktat sangat potensial untuk dijadikan sebagai pengawet makanan
alami Simon 2001. Hasil yang ditunjukkan pada percobaan ini menyimpulkan
0.01 0.02
0.03 0.04
0.05 0.06
0.07 0.08
0.09 0.1
3 6
9 12
15 18
21 24
K o
n se
n tr
a si
p ro
te in
m g
m l
Lama inkubasi jam
bahwa produksi bakteriosin pada NS9 tidak terdeteksi pada tahap penapisan awal dengan pengendapan menggunakan amonium sulfat 50.
4.3.4 Aktivitas antibakteri Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan untuk setiap supernatan yang
dikultivasi setiap tiga jam selama 24 jam terhadap bakteri uji dengan menggunakan metode difusi sumur agar. Hasil pengujian aktivitas antibakteri dan
dokumentasi gambar disajikan pada Lampiran 3 dan 4. Substansi antibakteri yang dihasilkan oleh isolat NS9 memiliki daya
inhibisi yang bervariasi pada kelima bakteri uji Gambar 11. Secara umum, substansi antibakteri yang dihasilkan bakteri isolat NS9 memiliki daya hambat
yang paling rendah untuk S. aureus dibandingkan daya hambat terhadap bakteri uji lainnya. Diameter penghambatan yang terbesar terjadi pada jam ke-12 pada
bakteri uji L. monocytogenes.
Gambar 11 Grafik perbandingan zona bening supernatan pada ke-5 bakteri uji: Escherichia coli
, Salmonella typhimurium , Listeria monocytogenes
, Bacillus cereus
, dan Staphylococcus aureus .
Diameter penghambatan terbesar bagi bakteri B. cereus yaitu dengan diameter sebesar 6 mm terjadi di jam ke-12. Diameter penghambatan terbesar bagi
bakteri E. coli yaitu dengan diameter sebesar 6 mm terjadi pada jam ke-15. Diameter penghambatan terbesar bagi bakteri S. typhimurium yaitu dengan
diameter sebesar 6 mm terjadi pada jam ke-24. Diameter penghambatan terbesar bagi bakteri S. aureus yaitu dengan diameter sebesar 3 mm terjadi pada jam ke-21.
Bila dibandingkan dengan kontrol positif asam asetat, maka rata-rata diameter
1 2
3 4
5 6
7
3 6
9 12
15 18
21 24
D ia
m e
te r
Z o
n a
H a
m b
a t
m m
Lama Inkubasi jam
maksimum pada kelima bakteri uji pada jam ke-21 setara dengan rata-rata diameter kontrol positif asam asetat antara 0,6 – 0,8 .
Gambar 12 Grafik perbandingan zona bening kontrol positif pada ke-5 bakteri uji: Escherichia coli
, Salmonella typhimurium , Listeria monocytogenes
, Bacillus cereus , dan Staphylococcus aureus
. Daya hambat zat antibakteri asam organik terhadap kelima bakteri patogen
tersebut juga dipengaruhi oleh pH. Batas toleransi pH untuk pertumbuhan kelima bakteri uji tersebut dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Toleransi bakteri patogen terhadap pH untuk tumbuh optimum
Jenis Bakteri pH
minimum pH
optimum pH
maksimum
Salmonella typhimurium 4,0
6,6-8,2 9,0
Listeria monocytogenes 4,3
7,0 9,4
Escherichia coli 4,0
7,0 9,0
Staphylococcus aureus 4,0
6,0-7,0 10,0
Bacillus cereus 5
6,5 8,8
Sumber: ICMSF 1996 diacu dalam Theron dan Lues 2011
Bakteri patogen seperti L. monocytogenes dan B. cereus terhambat maksimum pada jam ke-12 dimana pada jam tersebut, pH supernatan mencapai 4
Gambar 11. Pada jam tersebut, kedua bakteri uji tersebut sudah tidak mampu mentolerir pH yang terjadi sehingga mengakibatkan zona hambat yang terbentuk
telah mencapai titik maksimal pada jam ke-12. Bakteri uji seperti E. coli dan S. typhimurium adalah bakteri Gram negatif.
Keduanya termasuk ke dalam golongan bakteri enteropatogenik. Bakteri jenis ini biasanya tahan terhadap pH yang cukup rendah. Korelasi dengan zona bening
yang terbentuk adalah, butuh konsentrasi asam organik yang lebih banyak untuk
2 4
6 8
10
0.20 0.40
0.60 0.80
1
D ia
m e
te r
Z o
n a
H a
m b
a t
m m
Konsentrasi Asam Asetat
menghambat bakteri ini. Gambar 11 menunjukkan bahwa zona bening maksimum yang ditunjukkan pada bakteri uji E. coli terbentuk pada jam ke-15, lebih lama
daripada bakteri uji L. monocytogenes dan B. cereus. Begitu juga dengan bakteri uji S. typhimurium. Zona hambat maksimum ditunjukkan pada jam ke-24.
Menurut Alvarez-Ordonez et al. 2009, S. typhimurium diketahui dengan kemampuannya bertahan hidup pada pH ekstrim, yaitu 3. Namun kemampuan
hidup pada pH ekstrim tersebut tidak menjadikan bakteri ini dapat hidup dengan normal ketika bereaksi dengan asam organik. Sifat adaptasi asam dari
S. typhimurium juga didapat dari peningkatan osmotik, toleransi terhadap garam, dan proteksi silang menjadi sistem laktoperoksidase yang aktif.
Daya hambat asam organik yang dihasilkan isolat NS9 terhadap S. aureus paling rendah dibandingkan dengan bakteri uji lainnya. Sesuai dengan hasil
penelitian, Linke dan Goldman 2011 menyatakan hal ini disebabkan karena daya adhesivitas dinding sel S. aureus yang rendah. Gaya intermolekul seperti Van der
Waals, elektrostatis, kelarutan, dan interaksi sterik mengontrol bagaimana dinding sel bakteri berinteraksi dengan permukaan zat lain.
Menurut Theron dan Lues 2011, setiap bakteri uji memiliki ketahanan masing-masing terhadap jenis asam organik yang berbeda. L. monocytogenes
memiliki kerentanan yang lebih besar terhadap asam laktat dibandingkan dengan asam asetat. E. coli dan S. typhimurium memiliki kerentanan yang tinggi terhadap
asam laktat dan asam asetat. B. cereus yang merupakan golongan bakteri Gram positif memiliki kerentanan yang tinggi terhadap asam laktat dan asam propionat.
Bakteri uji S. aureus memiliki ketahanan asam yang paling tinggi dibandingkan dengan kelima bakteri uji lainnya. Charlier et al. 2009 menyatakan bahwa
S. aureus akan bertambah rentan terhadap asam apabila terjadi peningkatan kadar garam. Bakteri S. aureus juga sangat peka terhadap aktivitas asam asetat.
Perbedaan nilai zona bening yang dihasilkan dalam penelitian ini menunjukkan bahwa pada jam tertentu, salah satu jenis asam organik yang
dihasilkan oleh isolat BAL NS9 diproduksi dalam kondisi optimum, sehingga menghambat bakteri uji yang rentan terhadap salah satu jenis asam organik
tersebut. Bakteri L. monocytogenes yang telah mencapai zona hambat terbaik pada jam ke-12 menunjukkan bahwa pada jam tersebut, kemungkinan terbentuknya
asam laktat dan asam propionat mencapai titik tertinggi. Kondisi yang sama dapat dijelaskan pada bakteri uji E. coli dan S. typhimurium. Menurut Alvarez-Ordonez
et al. 2009, kedua bakteri uji ini rentan terhadap aktivitas antibakteri dari asam laktat dan asam asetat. Kondisi maksimum zona hambat yang terjadi pada E. coli
di jam ke-15 menunjukkan bahwa pada jam tersebut, kandungan asam asetat dan asam laktat dalam supernatan antibakteri terdapat pada kondisi yang maksimum.
Zona hambat maksimum yang terjadi pada bakteri S. typhimurium lebih lama dari E. coli disebabkan karena bakteri S. typhimurium lebih tahan asam dibandingkan
bakteri E. coli.
5 KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
