difraksinasi dengan etilasetat sebanyak 100 ml, dilakukan tiga kali, diperoleh fraksi etilasetat dan fraksi air. Fraksi n-heksana, fraksi kloroform, fraksi etilasetat
dan fraksi air masing-masing dipekatkan Rohman, 2009.
3.9 Analisis Fraksi Etilasetat secara KLT
Analisis dengan kromatografi lapis tipis KLT berguna untuk mendapatkan fase gerak yang terbaik. Fase gerak yang terbaik adalah fase gerak
yang dapat menghasilkan bercak paling banyak yang digunakan untuk fase gerak pada kromatografi kolom. Terhadap fraksi etilasetat dilakukan analisis secara
KLT menggunakan fase diam silika gel F
254
Cara kerja: dan fase gerak campuran n-
heksana:etilasetat dengan perbandingan 100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40;60, 30:70, 20:80, 10:90, 0:100 diamati dengan visual,
sinar UV 254 nm dan 366 nm.
Fraksi etilasetat dilarutkan dalam metanol, ditotolkan pada plat lapis tipis, kemudian dimasukan ke dalam chamber yang telah jenuh dengan uap fase gerak.
Pengembangan selesai, lalu plat dikeluarkan dan dikeringkan, plat diamati dengan visual, sinar UV 254 nm dan 366 nm. Amati warna yang terbentuk dan dihitung
harga Rf dari semua bercak. Fase gerak yang menghasilkan noda bercak paling banyak adalah fase gerak yang terbaik Gritter, et al., 1991. Hasil analisis KLT
fraksi etilasetat dapat dilihat pada Lampiran 5, halaman 57.
3.10 Pemisahan Fraksi Etilasetat dengan Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom dipakai untuk memisahkan campuran kepada komponen-komponennya. Kandungan kimia yang terdapat dalam ekstrak
Universitas Sumatera Utara
etilasetat dipisahkan secara kromatografi kolom menggunakan pelarut landaian n- heksana:etilasetat. Fase diam silika gel 60 H ukuran partikel 0,063-0,200 mm
mesh 70-230 ASTM. Cara kerja:
Seperangkat alat kromatografi kolom dipasang sedemikian rupa dan pada dasar kolom dimasukkan kapas yang telah bebas dari lemak, kemudian
dimasukkan larutan fase gerak. Silika gel 60 H dibuat bubur dengan larutan fase gerak yaitu n-heksana sampai bebas gelembung udara, kran dibuka kemudian
bubur silika dimasukkan ke dalam kromatografi kolom secara perlahan-lahan sambil dinding kolom diketuk-ketuk dan fase gerak tetap dialiri sampai silika gel
turun, lalu didiamkan sampai kolom kompak, selanjutnya fase gerak diturunkan sampai setinggi lebih kurang 1cm di atas fase diam, kran ditutup. Lapisi bagian
atas dengan kertas saring kemudian fraksi etilasetat yang sebelumnya telah dicampur dengan silika gel 60 H dimasukkan ke dalam bejana kromatografi
kolom sambil fase gerak ditambah sedikit demi sedikit dari pelarut non polar hingga pelarut polar dan larutan akan turun, dibuka kran perlahan sambil fase
gerak terus ditambah. Eluat yang keluar ditampung dalam vial, masing-masing sebanyak 5 ml. Hasil dipantau dengan kromatografi lapis tipis menggunakan fase
gerak n-heksana:etilasetat 40:60, diamati dengan visual, sinar UV 254 nm dan 366 nm. Untuk eluat yang mempunyai pola kromatogram yang sama digabung
menjadi satu fraksi Sastrohamidjojo, 1985. Hasil kromatografi kolom dapat dilihat pada Lampiran 6, halaman 63.
Universitas Sumatera Utara
3.11 Isolasi Senyawa Flavonoid Hasil Kromatografi Kolom
Terhadap fraksi hasil kromatografi kolom yang memberikan hasil pemeriksaan positif terhadap flavonoid dilakukan isolasi secara KLT preparatif,
sebagai fase gerak digunakan n-heksana:etilasetat 40:60 dan fase diam silika gel F
254
Cara kerja: .
Fraksi ditotolkan berupa pita pada jarak 2 cm dari tepi bawah plat KLT berukuran 20x10 cm yang telah diaktifkan, setelah kering plat KLT dimasukkan
ke dalam bejana yang telah jenuh dengan uap fase gerak, pengembang dibiarkan naik membawa komponen yang ada, setelah mencapai batas pengembangan plat
dikeluarkan dari bejana lalu dikeringkan dan diamati dengan visual, sinar UV 254 nm dan sinar UV 366 nm. Bagian tengah plat yang sejajar dengan bercak dikerok
dan dikumpulkan, direndam dengan metanol selama satu malam lalu disaring kemudian pelarutnya diuapkan sehingga diperoleh isolat Lenny, 2012. Hasil
KLT preparatif dapat dilihat pada Lampiran 7, halaman 66.
3.12 Uji Kemurnian Terhadap Isolat
