BAB 4 METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan studi potong lintang cross sectional study yang bersifat deskriptif analitik.
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Departemen THT-KL FK USU RSUP H. Adam Malik Medan. Pemeriksaan histopatologi jaringan hasil biopsi hidung dan
sinus paranasal dilakukan di Departemen Patologi Anatomi RSUP H. Adam Malik Medan. Pemeriksaan imunohistokimia untuk VEGF dilakukan di
Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU. Penelitian dilakukan mulai Mei 2009.
4.3 Populasi, Sampel, Besar Sampel dan Teknik Pengambilan Sampel 4.3.1. Populasi
4.3.1.1 Populasi target :
Semua penderita karsinoma hidung dan sinus paranasal
4.3.1.2 Populasi terjangkau : Semua penderita karsinoma hidung dan sinus
paranasal yang berobat ke RSUP. H. Adam Malik Medan mulai bulan Mei 2009 – Maret 2010.
Universitas Sumatera Utara
4.3.2. Sampel Penelitian
Sampel penelitian adalah seluruh penderita karsinoma hidung dan sinus paranasal berdasarkan anamnesis, pemeriksaan THT-KL
dan hasil biopsi histopatologi yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi sebagai berikut:
Kriteria inklusi:
a. Penderita karsinoma hidung dan sinus paranasal yang diagnosisnya ditegakkan berdasarkan hasil biopsi histopatologi
hidung dan sinus paranasal, baik laki-laki maupun perempuan pada semua kelompok usia, yang belum pernah mendapat
pengobatan dengan radiasi atau kemoterapi sebelumnya. b. Bersedia diikutsertakan dalam penelitian.
Kriteria eksklusi:
Penderita karsinoma hidung dan sinus paranasal yang diagnosisnya ditegakkan berdasarkan hasil biopsi histopatologi
hidung dan sinus paranasal yang sudah pernah mendapat pengobatan dengan operasi, radiasi atau kemoterapi.
4.3.3. Besar Sampel
Penentuan jumlah minimal sampel berdasarkan pengamatan pendahuluan dengan menggunakan rumus :
Universitas Sumatera Utara
n Z
2
α . P 1- P
d
2
n 1,96
2
. 0,83 . 0,17 0,15
2
n 24,09 Æ 25
n : jumlah sampel Z : nilai standar distribusi statistik pada kesalahan tertentu
α Error 0,05 = 1,96 P : Proporsi VEGF pada penderita karsinoma hidung dan sinus
paranasal = 83 Strauss et al, 2005 d : tingkat akurasi nilai estimasi dengan nilai sebenarnya = 15
Besar sampel yang didapat minimal 25 orang.
4.3.4. Teknik Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel penelitian adalah secara non probability consecutive sampling yaitu setiap pasien yang memenuhi kriteria
penelitian dimasukkan kedalam penelitian sampai kurun waktu tertentu, sehingga jumlah pasien yang diperlukan terpenuhi
Sastroasmoro, 1995.
4.4 Variabel Penelitian 4.4.1. Klasifikasi Variabel Penelitian
a. Variabel tergantung dependent: VEGF.
Universitas Sumatera Utara
b. Variabel bebas independent: Karsinoma hidung dan sinus paranasal, jenis histopatologi dan stadium.
4.4.2. Definisi Operasional Variabel
a. Karsinoma hidung dan sinus paranasal adalah tumor ganas yang berasal dari epitel yang berasal dari hidung dan sinus paranasal.
b. Diagnosis tumor hidung dan sinus paranasal ditegakkan oleh ahli THT-KL dengan dijumpainya gejala klinis dan hasil biopsi hidung
dan sinus paranasal dijumpai jenis histopatologi karsinoma hidung dan sinus paranasal.
c. Pemeriksaan nasoendoskopi biopsi adalah tindakan biopsi terhadap massa di kavum nasi melalui kavum nasi dengan menggunakan
Blakesley nasal forceps lurus, 13 cm dengan tuntunan rigid nasal endoscopy 4mm, sudut 0
. d. Pemeriksaan biopsi massa tumor di sinus dilakukan durante operasi
e. Pemeriksaan immunohistokimia adalah suatu cara mendeteksi antigen dalam jaringan dengan menggunakan antibodi tertentu.
f. Ekspresi VEGF adalah kadar VEGF dalam sitoplasma sel danatau membran sel sesuai hasil pemeriksaan imunohistokimia.
Positif bila dijumpai pewarnaan merah kecoklatan pada sitoplasmamembran sel:
0 : negatif 1 : lemah 10 ekspresi pada sel-sel tumor
Universitas Sumatera Utara
2 : sedang 10-50 ekspresi pada sel-sel tumor 3 : kuat 50 ekspresi pada sel-sel tumor
Nilai 2 - 3 dianggap overekspresi VEGF
g. Stadium tumor adalah penentuan stadium penyakit berdasarkan klasifikasi American Joint Committee on Cancer AJCC 2006.
Stadium karsinoma hidung dan sinus paranasal adalah: Tis
N0 M0
I T1
N0 M0
II T2
N0 M0
III T3
N0 M0
T1 N1
M0 T2
N1 M0
T3 N1
M0 IVA
T4a N0
M0 T4a
N1 M0
T1 N2
M0 T2
N2 M0
T3 N2
M0 T4a
N2 M0
IVB T4b
semua N
M0 semua T
N3 M0
IVC semua T
semua N M1
Universitas Sumatera Utara
4.5 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah jaringan hidung dan sinus penderita karsinoma hidung dan sinus paranasal.
Bahan jaringan diperiksa untuk mendapatkan ekspresi Vascular Endothelial Growth Factor VEGF dengan pemeriksaan
imunohistokimia.
4.6 Instrumen Penelitian
Penelitian ini membutuhkan beberapa bahan, reagen dan peralatan sebagai berikut :
a. Bahan untuk pemeriksaan histopatologi Formalin 10, blok parafin, aqua destillata, hematoxyllin-eosin.
b. Bahan untuk pemeriksaan immunohistokimia Xylol, alkohol absolut, alkohol 95, alkohol 80, alkohol 70, H2O2 0,5
dalam methanol, phosphat buffer saline PBS, antibodi VEGF, antibodi sekunder, Envision, chromogen diamino benzidine DAB, Lithium
Carbonat jenuh, tris EDTA, hematoxyllin, aqua destillata. c. Alat untuk biopsi
Blakesley nasal forcep lurusbengkok, endoskopi kaku, 4 mm, 0 ˚.
d. Alat untuk pemeriksaan immunohistokimia Sistem visualisasi immunohistokimia Envision kit, mesin pemotong
jaringan microtome, silanized slide.
Universitas Sumatera Utara
Prosedur kerja imunohistokimia pada blok parafin : 1. Preparasi setelah potong jaringan sediaanslide : sediaan dipanaskan di
microwave high level selama 5 menit. 2. Selanjutnya sediaan dideparafinisasi dengan xylol I – II – III masing-
masing selama 5 menit, cuci dalam air mengalir selama 5 menit. 3. Bloking peroksidase endogen H2O2 0,5 dalam metanol selama 30
menit. 4. Selanjutnya cuci dengan air mengalir selama 5 menit.
5. Beri Tris EDTA untuk pretreatment dalam microwave : Cook I : power level tinggi selama 5 menit.
Cook II : power level medium selama 5 menit. Lalu didinginkan kurang lebih 45 menit.
6. Cuci dengan PBS pH 7,4, selanjutnya batasi jaringan dengan Pap-Pen. 7. Bloking aktivitas non spesifik dengan serum normal selama 20’.
8. Inkubasi sediaan dengan antibodi primer VEGF selama satu malam dalam suhu 4° dalam kulkas.
9. Cuci dengan PBS pH 7,4. 10. Selanjutnya inkubasi dengan Envision selama 30 menit.
11. Cuci dengan PBS pH 7,4 - Twin 20 lalu PBS masing-masing selama 5 menit.
12. Selanjutnya sediaan diberi chromogen agar berwarna dengan DAB Diamino Benzidin selama kurang lebih 5 menit.
Universitas Sumatera Utara
13. Cuci dengan air mengalir. 14. Counterstain dengan Hematoxyllin Lilie Mayers.
15. Cuci dengan air mengalir. 16. Lithium Carbonat jenuh 5 dalam aquadest selama 1-2 menit.
17. Cuci dengan air mengalir. 18. Selanjutnya lakukan dehidrasi dengan alkohol bertingkat alkohol 80,
alkohol 96, alkohol absolut I dan II masing-masing selama 5 menit. 19. Clearing dengan xylol I, II dan III masing-masing selama 5 menit.
20. Tutup dengan Entellan dan cover glass. 21. Bisa langsung dibaca.
Universitas Sumatera Utara
4.7 Kerangka Kerja
Kategori