Tempat Pelaksanaan Penelitian Metode Penelitian Rancangan Penelitian Pembuatan Ekstrak Etanol dari Daun Kecipir Secara Perkolasi.

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Tempat Pelaksanaan Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU dan Balai Laboratorium Kesehatan Medan.

3.2 Metode Penelitian

Penelitian dilakukan dengan metode eksperimental dengan tahapan meliputi pengumpulan sampel, pembuatan simplisia, pemeriksaan karakteristik simplisia, uji golongan senyawa kimia, pembuatan ekstrak dan uji aktivitas antibakteri dari ekstrak daun kecipir terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa. Penentuan aktivitas antibakteri ekstrak daun kecipir dilakukan dengan metode difusi agar. Prinsip metode ini adalah menggunakan media padat dan pencetak lubang kemudian diameter hambat zona jernih bakteri diukur dengan jangka sorong. 3.3 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat Alat- alat yang digunakan adalah alat perkolator, alat-alat gelas, alat penentuan kadar air, aluminium foil, autoklaf Webeco, blender National, botol bertutup, cawan penguap rata, cawan penguap, cawan petri, desikator, freeze dryer Modulio, inkubator Memmert, jarum ose, jangka sorong, kaca preparat, kaca penutup, kertas perkamen, krus porselin, lampu bunsen, lemari pendingin Universitas Sumatera Utara Toshiba, lemari pengering, mikroskop Olympus, neraca kasar Ohaus, neraca listrik Mettler Toledo, oven listrik Fisher scientific, pinset, penangas air, pencetak lubang, rotary evaporator Haake D, spatula dan tanur Ney M 525 Series II.

3.3.2 Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun kecipir, etanol

96 teknis, air suling, suspensi Mc. Farland, Mueller Hinton Agar Difco, biakan bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 , Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, larutan fisiologis NaCl 0,9, dan bahan yang berkualitas pro analisa E-Merck kecuali dinyatakan lain: alfa naftol, asam asetat anhidrida, asam klorida pekat, asam klorida 2 N, asam nitrat, asam sulfat pekat, asam sulfat 2 N, besi III klorida, bismut III nitrat, benzen, etanol, isopropanol, iodium, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform, metanol, natrium hidroksida, natrium sulfat anhidrat, raksa II klorida, serbuk magnesium, serbuk zink, timbal II asetat, toluen dan timbal II asetat. 3.4 Penyediaan sampel 3.4.1 Pengumpulan sampel Sampel yang dipergunakan adalah daun kecipir Psophocarpus tetragonolobus L. DC. yang diperoleh di Jalan Selambo, Kecamatan Amplas, Medan. Pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tanaman yang sama dari daerah lain. Gambar dapat dilihat pada Lampiran 2, halaman 50. Universitas Sumatera Utara

3.4.2 Determinasi sampel

Determinasi tanaman dilakukan oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor Jl. Raya Jakarta – Bogor Km. 46 Cibinong, Indonesia. Hasil identifikasi tanaman dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 49.

3.4.3 Pengolahan sampel

Daun kecipir dibersihkan dari kotoran dengan cara mencuci di bawah air mengalir hingga bersih, ditiriskan dan ditimbang berat basahnya 6,5 kg. Kemudian dikeringkan dalam lemari pengering pada suhu 40-60 o C. Daun kecipir dianggap kering apabila rapuh. Kemudian ditimbang berat kering simplisia yaitu 5,5 g. Selanjutnya simplisia diserbuk menggunakan blender dan disimpan dalam wadah plastik di tempat yang terlindung dari cahaya sebelum digunakan. Gambar simplisia daun kecipir dapat dilihat pada Lampiran 2, halaman 51.

3.5 Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian terdiri dari: a. Pemeriksaan karakteristik simplisia b. Uji golongan senyawa kimia c. Pembuatan ekstrak etanol daun kecipir secara perkolasi. d. Pengenceran larutan ekstrak etanol daun kecipir e. Uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun kecipir Universitas Sumatera Utara 3.6 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia 3.6.1 Pemeriksaan organoleptik Pemeriksaan secara organoleptik meliputi pemeriksaan warna, bau dan rasa dari daun segar dan simplisia kecipir.

3.6.2 Pemeriksaan makroskopik

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk luar dari daun segar dan simplisia daun kecipir.

3.6.3 Pemeriksaan mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap daun segar dan serbuk simplisia. Daun segar dipotong tipis secara melintang di atas kaca preparat lalu diteteskan larutan kloralhidrat dan dipanaskan diatas api bunsen kemudian ditutup dengan kaca penutup dan diamati di bawah mikroskop. Serbuk simplisia ditaburkan di atas kaca preparat, lalu diteteskan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup kemudian diamati di bawah mikroskop.

3.6.4 Penetapan kadar air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi Destilasi Toluen. Alat-alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung penyambung dan tabung penerima 5 ml. Cara kerja: kedalam labu alas bulat dimasukkan 200 ml toluen dan 2 ml air suling, didestilasi selama 2 jam, toluen didinginkan selama 30 menit dan volume air didalam tabung penerima dibaca kemudian kedalam labu dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian air terdestilasi kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 Universitas Sumatera Utara tetes tiap detik. Setelah air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, dibaca volume air dengan ketelitian 0,05 ml. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992.

3.6.5 Penetapan kadar sari larut dalam air

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995.

3.6.6 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 95 dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama kemudian didiamkan selama 18 jam lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 95 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995. Universitas Sumatera Utara

3.6.7 Penetapan kadar abu total

Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara kemudian ditarakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 600 o C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995.

3.6.8 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam

Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu didihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dan dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995. 3.7 Pembuatan Pereaksi 3.7.1 Pereaksi asam klorida 2 N Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1995. 3.7.2 Pereaksi asam sulfat 2 N Sebanyak 5,5 ml asam sulfat pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1995.

3.7.3 Pereaksi Lieberman-Burchard

Campurkan 5 bagian volume asam sulfat dengan 50 bagian volume etanol. Universitas Sumatera Utara Tambahkan hati-hati 5 bagian volume asam asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut, dinginkan Ditjen POM, 1995.

3.7.4 Pereaksi kloralhidrat

Larutkan 50 g kloralhidrat dalam 20 ml air Ditjen POM, 1995.

3.7.5 Pereaksi Mayer

Campurkan 60 ml larutan raksa II klorida dan 10 ml larutan kalium iodida, tambahkan air secukupnya hingga 100 ml Ditjen POM, 1995.

3.7.6 Pereaksi Bouchardat

Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam 20 ml air suling kemudian ditambah 2 g iodium sambil diaduk sampai larut lalu cukupka n dengan air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1980.

3.7.7 Pereaksi Dragendorff

Campur 20 ml larutan bismut III nitrat dalam asam nitrat lalu tambahkan dengan 50 ml larutan kalium iodida diamkan sampai memisah sempurna. Ambil larutan jernih dan encerkan dengan air secukupnya hingga 100 ml Ditjen POM, 1995.

3.7.8 Peraksi Molish

Sebanyak 3 g alfa naftol dilarutkan dengan sedikit etanol kemudian ditambahkan asam nitrat 0,5 N secukupnya hingga diperoleh 100 ml Ditjen POM, 1979.

3.7.9 Pereaksi besi III klorida 1

Ditimbang sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga diperoleh larutan 100 ml kemudian disaring Ditjen POM, 1995. Universitas Sumatera Utara

3.7.10 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M

Ditimbang sebanyak 15,17 g timbal II asetat dilarutkan dalam air hingga 100 ml Ditjen POM, 1995.

3.7.11 Pereaksi natrium hidroksida 2 N

Sebanyak 8,002 g natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling bebas CO 2 hingga diperoleh 100 ml larutan Ditjen POM,1979. 3.8 Uji Golongan Senyawa Kimia 3.8.1 Pemeriksaan steroidatriterpenoida Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbul warna ungu merah menunjukkan adanya triterpenoida atau warna hijau biru menunjukkan adanya steroida Farnsworth, 1966.

3.8.2 Pemeriksaan alkaloida

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk uji alkaloida sebagai berikut: a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer akan terbentuk endapan berwarna putih atau kuning. b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai kehitaman. c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Dragendorff akan terbentuk endapan merah atau jingga. Universitas Sumatera Utara Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan dua dari tiga percobaan diatas Depkes RI, 1989.

3.8.3 Pemeriksaan glikosida

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g kemudian disari dengan 30 ml campuran 7 ml bagian etanol 96 dan 3 bagian air suling ditambah dengan 10 ml HCL 2 N. Direfluks selama 30 menit, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok lalu didiamkan selama 5 menit dan disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran 3 bagian kloroform dan 2 isopropanol dilakukan berulang sebanyak tiga kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 o C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol kemudian diambil 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan kedalam tabung reaksi, diuapkan di penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish kemudian secara perlahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung jika terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya glikosida Depkes RI, 1989.

3.8.4 Pemeriksaan flavonoida

Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambahkan 100 ml air, didihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Kedalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.

3.8.5 Pemeriksaan saponin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok selama 10 detik. Universitas Sumatera Utara Jika terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes RI, 1989.

3.8.6 Pemeriksaan tanin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru atau kehitaman menunjukkan adanya tanin Depkes RI, 1989.

3.9 Pembuatan Ekstrak Etanol dari Daun Kecipir Secara Perkolasi.

Sebanyak 200 g serbuk simplisia dimasukkan kedalam bejana tertutup dan dibasahi dengan 500 ml cairan penyari etanol, didiamkan selama 3 jam kemudian massa dipindahkan sedikit demi sedikit kedalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati-hati, hingga memadat. Selanjutnya dituangi dengan cairan penyari secukupnya sampai cairan penyari mulai menetes dan diatas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari diatas lalu perkolator ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam. Kran perkolator dibuka dan diatur cairan menetes dengan kecepatan 1 mlmenit dan dipasang reservoir penyari sehingga tetap dapat dipertahankan selapis cairan penyari diatas serbuk simplisia. Perkolat dihentikan bila tetesan terakhir larutan penyari menjadi jernih. Perkolat yang dihasilkan diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 50 o C setelah itu dikentalkan dengan freeze dryer pada suhu 5 o C selama 24 jam lalu dipindahkan Universitas Sumatera Utara kedalam desikator sampai diperoleh ekstrak kental Ditjen POM, 1979. Bagan pembuatan ekstrak dapat dilihat pada Lampiran 5, halaman 58.

3.10 Sterilisasi alat