21
B. Metode Penelitian
Penelitian ini terdiri dari dua tahap, yaitu tahap persiapan bahan baku pembuatan bioplastik dan tahap penelitian utama. Penelitian utama terdiri dari
pembuatan dan karakterisasi bioplastik.
1. Persiapan Bahan Baku
Persiapan bahan baku bertujuan untuk memperoleh PHA sebagai bahan utama pembuatan bioplastik. Persiapan bahan baku terdiri dari tiga
tahap, yaitu persiapan substrat, kultivasi PHA, dan proses hilir PHA.
a. Persiapan substrat
Tahap pesiapan substrat meliputi proses pembuatan hidrolisat pati sagu secara enzimatis serta persiapan kultur dan media fermentasi.
i. Pembuatan hidrolisat pati sagu Akyuni, 2004
Suspensi pati sagu dalam air 30 bv diatur pH-nya 6-6,5 dengan penambahan CaCO
3
kemudian digelatinisasi sempurna dengan cara pemanasan 70-80
o
C dan mengaduknya hingga kental dan bening. Likuifikasi dilakukan dengan menambahkan Į-
amilase sebanyak 1,75 Ug pati ke dalam suspensi pati yang telah tergelatinisasi kemudian dipanaskan dan diaduk pada suhu 90-95
o
C selama 210 menit. Hasil likuifikasi selanjutnya disakarifikasi pada
suhu 60
o
C, pH 4-4,5 selama 48 jam pada inkubator goyang 150 rpm dengan menambahkan amiloglukosidase AMG sebanyak 0,3
Ug pati. Hidrolisat pati sagu hasil sakarifikasi dipanaskan pada suhu
105
o
C selama 5 menit untuk menginaktifkan enzim. Untuk menjernihkan warna, hidrolisat ditambah arang aktif 1-2 bobot
pati, dipanaskan 80
o
C selama satu jam lalu disaring vakum. Hidrolisat pati sagu tersebut telah siap digunakan sebagai sumber
karbon kultivasi PHA dan sebelumnya dilakukan analisis total gula metode Fenol Sulfat, total nitrogen Kjeldahl, kadar mineral
AASSpektofotometri Absorpsi Atom Apriyantono et al., 1989 dan profil gula High Performance Liquid Chromatography atau
22 HPLC. Diagram alir pembuatan hidrolisat pati sagu dapat dilihat
pada Lampiran 1. Prosedur analisis total gula dan nitrogen secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 2a dan 2b.
ii. Persiapan kultur dan media fermentasi Atifah, 2006
Kultur R. eutropha dipelihara dalam bentuk kering-beku. Kultur disegarkan setiap dua minggu dengan menumbuhkannya
pada media cair Nutrient Broth inkubasi 34
o
C selama 24 jam. Formulasi media kultivasi per liter adalah X ml hidrolisat pati
sagu dan Y gram NH
4 2
HPO
4
sedemikian sehingga rasio CN awal 10:1 dengan asumsi bahwa konsentrasi karbon pada hidrolisat pati
sagu adalah 40 dari total gula dan konsentrasi N pada NH
4 2
HPO
4
adalah 21,21; 5,8 gram K
2
HPO
4
; 3,7 gram KH
2
PO
4
; 10 ml MgSO
4
0,1 M; dan 1 ml larutan mikroelemen. Larutan mikroelemen terdiri dari 2,78 g FeSO
4
.7H
2
O; 1,98 g MnCl
2
.4H
2
O; 2,81 g CoSO
4
.7H
2
O; 1,67 g CaCl
2
.2H
2
O; 0,17 g CuCl
2
.2H
2
O dan 0,29 g ZnSO
4
.7H
2
O yang dilarutkan dalam 1 liter HCl 1 N. Sebelum digunakan, media terlebih dahulu disterilisasi pada
suhu 121
o
C selama 15 menit sumber karbon dan sumber nitrogen disterilisasi dalam wadah yang terpisah untuk menghindari reaksi
pencoklatan. Media didiamkan beberapa saat setelah disterilisasi sehingga suhunya mencapai 25-30
o
C dan siap diinokulasi. Untuk keperluan kultivasi, terlebih dahulu dilakukan propagasi
kultur dengan menumbuhkan kultur segar R. eutropha ke dalam media steril 10 vv pada inkubator goyang 150 rpm, suhu 34
o
C selama 24 jam. Komposisi media propagasi disesuaikan dengan
media yang akan digunakan pada kultivasi, volume kultur propagasi 10 dari volume media kultivasi. Kultur hasil propagasi
selanjutnya diinokulasikan ke dalam media kultivasi.
23
b. Kultivasi PHA secara fed-batch Atifah, 2006
Kategori