Tempat dan Waktu Definisi Operasional a. Desain Penelitian Pengamatan Kadar Testosteron

29

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu

Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium FMIPA Universitas Sumatera Utara dan laboratorium klinik Pramita Medan pada bulan Desember 2010 – Januari 2011. 3.2. Variabel Penelitian 3.2.1. Variabel Independent  Aktivitas fisik maksimal  Tocopherol

3.2.2. Variabel Dependent a.

Kadar testosteron dalam darah b. Jumlah Sperma c. Berat Testis Universitas Sumatera Utara 30

3.3. Definisi Operasional a.

Latihan fisik maksimal : aktivitas fisik yaitu berenang sampai kelelahan. b. Vitamin E : 2 mg α-tokoferol asetat dalam 0,5 ml larutan. c. Kadar testosteron : jumlah testosteron dalam nano gram yang terdapat dalam 1 ml darah. d. Jumlah sperma : banyaknya sperma yang diperoleh dari cauda epididimis dalam 1 ml suspensi. e. Berat Testis : satuan ukuran untuk menyatakan massa jaringan testis g.

3.4. Bahan Penelitian Bahan Biologis. Bahan biologis yang akan digunakan dalam penelitian

adalah mencit jantan Mus musculus L. strain DD Webster dewasa fertil berumur ± 3 bulan dengan berat badan 25-35 gram yang diperoleh dari FMIPA Biologi Universitas Sumatera Utara USU Medan. Jumlah hewan coba perkelompok ditentukan ditentukan dengan rumus t-1 n-1 ≥ 15 Federer., 1963. Jika t adalah jumlah perlakuan dalam perlakuan ini ada 5 kelompok pelakuan dan n adalah jumlah ulangan perkelompok, maka jumlah n yang diharapkan secara teoritis adalah 5. Sehingga jumlah keseluruhan hewan coba yang diperlukan dalam penelitian ini adalah 25 ekor yang dipilih dari hasil perbanyakan untuk keperluan penelitian. Universitas Sumatera Utara 31 Bahan Kimia. Bahan kimia yang dibutuhkan pada penelitian ini terdiri atas vitamin E murni Merck, Germany. Dalam bentuk vitamin E cair dl- α- tochopherol asetat, aquades, NaCl 0,9, alkohol 70.

3.4.1. Peralatan Utama Penelitian

Alat utama yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas : a. Axsym system abbott b. Mikropipet 50-200 ul c. Bak bedah dan dissecting set d. Kaca arlogi e. Timbangan sartorius 2402 f. Cawan petri g. Kamar hitung Improved Neubauer h. Kaca objek dan mikroskop cahaya

3.5. Desain Penelitian

Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental yang didesain mengikuti Rancangan Acak Lengkap RAL. Penelitian ini terdiri atas 5 kelompok perlakuan, yaitu : Universitas Sumatera Utara 32 a. Kelompok I P0 = terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa yang tidak diberi perlakuan kelompok kontrol. b. Kelompok II P1 = terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa yang diberi latihan fisik setiap hari selama 35 hari. c. Kelompok III P2 = terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa yang diberi latihan fisik maksimal dan aquades selama 35 hari d. Kelompok IV P3 = terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa yang diberi latihan fisik maksimal setiap hari selama 20 hari pertama, kemudian 15 hari berikutnya diberikan latihan fisik maksimal dan vitamin E 2 mghari per oral setiap hari. e. Kelompok V P4 = terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa yang diberi latihan fisik maksimal dan vitamin E 2 mghari per oral setiap hari selama 35 hari. Universitas Sumatera Utara Mencit ditempatkan ke dalam kelompok secara random. 33 P4 LFM + Vit. E P3 LFM LFM + Vit. E P2 LFM + Aquadest 0,5 ml P1 Latihan Fisik Maksimal LFM P0 Kontrol 35 hari 20 3.6. Pelaksanaan Penelitian 3.6.1. Pemeliharaan Hewan Coba Mencit diaklimatisasikan selama satu minggu dan ditempatkan di dalam kandang yang terbuat dari bahan plastic ukuran 30 x 20 x 10 cm yang ditutup dengan kawat kasa. Dasar kandang dilapisi dengan sekam padi setebal 0,5-1 cm dan diganti setiap tiga hari. Cahaya ruangan dikontrol persis 12 jam terang pukul 06.00 sampai dengan pukul 18.00 dan 12 jam gelap pukul 18.00 sampai dengan pukul 06.00, sedangkan suhu dan kelembapan ruangan dibiarkan berada pada kisaran alamiah. Pakan pelet komersial dan minum air PAM disuplai setiap Universitas Sumatera Utara 34 hari secara berlebih. Ethical clearance diperoleh dari Komite Etik Penelitian Dewan Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara.

3.6.2. Pemberian Latihan Fisik Maksimal

Pemberian latihan fisik maksimal dilakukan dengan cara berenang sampai kelelahan Laksmi, 2010: Jawi et al., 2008: Yu et al., 2006: Leeuwenburgh and LL 1998. Mencit diberenangkan di dalam wadah kasa ukuran 100 x 50 x 80 cm vena diisi dengan air setinggi 60 cm tidak ada jalan keluar. Sebagai usaha untuk keluar dari wadah, maka tikus tersebut akan berenang, menyelam dan memanjat dinding wadah dengan sekuat tenaga.Pada saat mencit berhenti dari segala gerakannya kecuali gerakan untuk bertahan hidup dalam hal ini mempertahankan kepalanya tetap berada di permukaan air, maka inilah mencit dianggap telah melakukan latihan fisik maksimal dan setelah itu segera dikeluarkan dari wadah, lalu di keringkan dengan handuk sampai bulunya kering dan kembalikan ke dalam kandang.

3.6.3. Pemberian Tocopherol

Tocopherol yang akan diberikan adalah dalam bentuk dl- α-tocoperol asetat yang dilarutkan dalam aquades. Adapun dosis tocopherol yang akan diberikan adalah sebesar 2mghari per oral dalam 0,5 ml larutan Verma et al., 2001. Universitas Sumatera Utara 35

3.6.4. Pengambilan Testosteron

Pada awalnya mencit dimatikan dengan cara mendislokasikan leher mencit lalu ditelengkankan kemudian difiksasi dengan peniti pada keempat ekstremitas. Dinding perut dijepit dengan pinset dan digunting pada bagian perut bawah lalu dilebarkan kearah kiri dan kanan dinding perut akan terlihat isi perut lalu dicari diapragma lalu digunting dan akan terlihat jantung kemudian lakukan pengambilan darah dengan spuit insulin melalui ventrikel kiri secara perlahan- lahan.

3.6.5. Pengamatan

Pengamatan dilakukan setelah 35 hari perlakuan, dimana masing-masing hewan coba akan dikorbankan dengan cara melakukan dislokasi dibagian leher dan selanjutnya dibedah. Adapun pengamatan dilakukan sebagai berikut :

a. Pengamatan Kadar Testosteron

Pengamatan dilakukan pada hari ke-35 pada semua kelompok, baik kelompok kontrol maupun kelompok perlakuan. Kadar testosteron diperiksa dengan menggunakan metoda MEIA Microparticle Enzyme Immunoassay. Solid Phase Receptacle SPR yang digunakan pada pemeriksaan ini merupakan fase solid seperti pipet. Reagensia pada pemeriksaan ini siap pakai dan tersimpan dalam satu bungkus reagensia strip. Semua lanngkah pemeriksaan ini dilakukan secara otomatis didalam alat. Universitas Sumatera Utara 36 Sampel, mikropartikel solut antitestosteron dan agent pemindah testosterone sudah ada didalam pipet sebagai sampel pemeriksaan didalam satu wadah dari reaction vessel RVSPR. Sampel dimasukkan kedalam well yang berisi alkalin pospatase berlabel testosterone konjugat. Sampel dan konjugat dicampu masuk dan keluar SPR pada waktu tertentu dan kecepatan reaksi tertentu antigen akan dikaitkan dengan antibodi yang telah dilekatkan oleh reaction vessel RV dan konjugat membentuk ikatan “sandwich”. Komponen yang tidak terikat akan dihilangkan pada saat pencucian. Pada langkah akhir reaksi substrat 4-Methyl-umbelliferyl phospat akan berputar masuk dan keluar RV. Enzyme konjugat katalisator akan menghidrolisa substrat menjadi product flourecent 4-Methyl-umbelliferone. Flouresensi ini diukur pada panjang gelombang 450 nm. Intensitasnya sebanding dengan konsentrasi Testosteron dalam serum.

b. Pengamatan Jumlah Sperma