DESAIN PENELITIAN TEMPAT WAKTU DAN PENELITIAN PERKIRAAN BESAR SAMPEL MASALAH BATASAN DAN DEFENISI OPERASIONAL

20

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1. DESAIN PENELITIAN

Penelitian ini merupakan penelitian observational dengan metode potong lintang.

3.2. TEMPAT WAKTU DAN PENELITIAN

Penelitian dilakukan di Departemen Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara RSUP Haji Adam Malik Medan. Penelitian dilakukan pada bulan Juli 2012 sampai dengan September 2012. 3.3. POPULASI DAN SUBJEK PENELITIAN 3.3.1. Populasi Penelitian Populasi penelitian adalah mahasiswa Akademi Analis D3 Banda Aceh yang melakukan pemeriksaan kesehatan di laboratorium RSUP Haji Adam Malik Medan, mahasiswa Akademi Tehnik dan Keselamatan Penerbangan ATKP Medan dan mahasiswa Akademi Pariwisata Medan yang melakukan pemeriksaan kesehatan di laboratorium Pramita Medan.

3.3.2. Subjek Penelitian

Mahasiswa yang memenuhi kriteria inklusi. 3.4 KRITERIA PENELITIAN

3.4.1. Kriteria inklusi

1. Bersedia ikut dalam penelitian dengan menandatangani informed consent. 2. Mahasiswa dengan MCV80 pg dan MCH27 fl. Universitas Sumatera Utara 21

3.5 PERKIRAAN BESAR SAMPEL

Sampel dipilih berdasarkan non random sampling secara consecutive sampling dengan jumlah sampel diambil secara total sampling.

3.6. ANALISA DATA

Analisa data dilakukan menggunakan software SPSS Statistical Package for Social Sciences, Chicago, IL, USA for Windows, data ditampilkan dalam bentuk tabel dan grafik. 3.7. BAHAN DAN CARA KERJA 3.7.1. Pengambilan Sampel Sampel darah dari remaja yang melakukan pemeriksaan kesehatan di laboratorium Pramita Medan dibawa ke laboratorium Patologi klinik RSUP.H.Adam Malik Medan untuk dilakukan pemeriksaan Complete Blood Count CBC dan pemeriksaan kuantitasi HbA2 dengan metode hemoglobin elektroforesis kapiler. Sampel darah diambil dari vena mediana cubiti. Tempat Punksi vena terlebih dahulu dilakukan tindakan aseptik dengan alkohol 70 dan dibiarkan kering, kemudian dilakukan punksi dengan menggunakan vacutainer EDTA 3 ml 5,4 mg. 3.7.2. Pengolahan dan Pemeriksaan Sampel 3.7.2.1. Pengolahan Sampel Tabung K2EDTA yang telah diisi 3 ml darah dihomogenkan terlebih dahulu, untuk pemeriksaan CBC dengan menggunakan Sysmex XT 2000i sebagai penyaringan indeks hematologi untuk mendapatkan sampel mikrositer hipokrom dengan MCV80 fl, MCH27 pg WHO,1994 , selanjutnya dilakukan pemeriksaan kuantitasi HbA2, dengan menggunakan alat Minicapillary Electrophoresis dari Sebia Sebia, Norcross,GA. Pada pemeriksaan nilai kuantitasi HbA2 sebaiknya menggunakan darah segar untuk dianalisa. 3 ml darah K2EDTA di sentrifus 15 menit 4.000 rpm. Selanjutnya plasma dibuang. Sebelum dilakukan pemeriksaan, sampel divortex terlebih dahulu. Universitas Sumatera Utara 22

3.7.2.2. Pemeriksaan Indeks Hematologi

Sebanyak 3 mL darah dimasukkan kedalam tabung K2EDTA dan dihomogenkan perlahan. Analisa dilakukan menggunakan automatic cell counting Sysmex XT-2000i untuk memperoleh nilai MCV dan MCH dengan pemeriksaan CBC complete blood count. Pemeriksaan CBC terdiri dari kadar hemoglobin Hb, jumlah eritrosit RBC, leukosit WBC, hematokrit HCT, nilai rata-rata eritrosit MCV,MCH, MCHC, RDW, trombosit PLT. Pemeriksaan ini harus selesai dalam waktu 1 jam setelah pengambilan sampel.

3.7.2.3. Pemeriksaan Nilai Kuantitasi HbA2

Pemeriksaan nilai HbA2 dilakukan dengan menggunakan alat Minicapilarry electrophoresis dari Sebia Sebia, Norcross,GA. Sistem ini menggunakan prinsip elektroforesis kapiler di dalam larutan bebas, dengan molekul yang bermuatan dipisahkan berdasarkan mobilitas elektroforesis pada larutan bufer alkali dengan pH spesifik pH 9,4. Kecepatan migrasi tergantung aliran elektroosmotik yang bergerak menuju katoda, sehingga akan menyebabkan aliran bufer dari anoda ke katoda. Pencacahan hemoglobin dipisahkan di kapiler silica yag dideteksi dengan panjang gelombang 415 nm. Selanjutnya hasil dapat dilihat dalam bentuk elektroforetrogram dan dievaluasi. Pada metode ini HbA2 dapat dipisahkan dari HbE, HbC dan HbS . Untuk mendiagnosa β-Thalassemia Trait digunakan Cutoff HbA2 3,5. Reagensia yang digunakan: 1. Bahan kontrol HbA2 normal SEBIA, cat: PN 4778 yang berasal dari darah manusia normal. Pada penelitian ini menggunakan 1 vial kontrol HbA2 normal dalam bentuk lypholized. Selanjutnya kontrol HbA2 dilarutkan dengan 1 ml H2O, kemudian dibiarkan selama 30 menit, dicampur jangan sampai berbusa. Kontrol yang telah dicampur homogen, diletakkan kedalam aliquot yang masing- masing berisi 500 μl. Lalu disimpan di dalam kulkas dengan suhu -40 ⁰C. Universitas Sumatera Utara 23 2. Bufer dengan pH 9,4 SEBIA, cat: PN 2207 stabil pada suhu 2-8 ⁰C dengan volume 250 ml. 3. Larutan hemolysing untuk mengencerkan dan melisiskan eritrosit dengan volume 250 ml. 4. Wash solution, untuk mencuci kapiler sebelum dan sesudah pemeriksaan elektroforesis hemoglobin. Larutan wash solution sebanyak 25 ml ditambah air suling 225 ml, sehingga volume wash solution menjadi 250 ml. 5. H2O 6. Reagen cup, untuk tempat sampel dan bufer. 7. Filter yang terdapat didalam bufer, dan wash solution 8. Label untuk larutan pelisis hemolysing 10. Label untuk larutan kontrol HbA2 normal Alat : 1. Pipet tetes 2. Centrifuge 3. Aliquot 4. Vorteks 5. Tabung vakum 3 ml berisi antikoagulan EDTA Cara Kerja: 1. Darah EDTA yang telah diputar dikeluarkan dari dalam kulkas, dan ditunggu hingga sama dengan suhu ruangan. 2. Kontrol yang telah di larutkan, dikeluarkan dari dalam kulkas , hingga sama dengan suhu ruangan. Sebelum menjalankan sampel terlebih dahulu menjalankan kontrol HbA2 normal. 3. Alat minicap dalam keadaan ready. 4. Buka pintu minicap dan letakkan tabung kontrol yang telah Universitas Sumatera Utara 24 dilabel barcode kontrol di posisi 28 dan larutan hemolysing di posisi 27. Tutup pintu maka alat akan secara otomatis melakukan pemeriksaan. 5. Selanjutnya masukkan data kontrol dengan memasukkan data lot reagen. 6. Setelah alat dalam keadaan ready kembali, maka hasil dapat dilihat dengan menekan gambar grafik, dan hasil kontrol HbA2 normal dapat dicetak. Sebelum sampel dikerjakan terlebih dahulu kontrol HbA2 dikeluarkan dan hemolysing tetap berada di posisi 27. 7. Letakkan bahan pemeriksaan yang sebelumnya telah disentrifus 4000 rpm selama 15 menit, dibuang plasma, pada posisi 1 dan seterusnya sesuai dengan jumlah pasien yang akan diperiksa. 8. Alat ditutup dan secara otomatis melakukan pemeriksaan. 9. Setelah ready , hasil dapat dilihat di result eksplorer. Selanjutnya dapat dimasukkan data pasien dan dicetak ². 3.8. PEMANTAPAN KUALITAS 3.8.1. Pemantapan kualitas pemeriksaan CBC Dilakukan dengan menjalankan program kontrol pada Sysmex XT-2000i. Menggunakan darah kontrol yang telah diketahui nilainya, yaitu rendah, normal dan tinggi. Sebelum darah kontrol dianalisa, pastikan file pemantapan kualitas telah disiapkan. Homogenkan darah kontrol dengan baik dan benar, lalu lakukan analisa. Pastikan hasil pemantapan kualitas masuk ke dalam data nilai target. Lakukan analisa darah control untuk ketiga sampel kontrol. Data hasil pemeriksaan akan tersimpan secara otomatis. Universitas Sumatera Utara 25

3.8.2. Untuk pemantapan kualitas pada pemeriksaan HbA2.

Dilakukan dengan menjalankan kontrol Normal HbA2 . Setelah dianalisa maka akan didapatkan nilai dari HbA dan HbA2. Nilai di masukkan kedalam box QC medium, meliputi lot number, jumlah kapiler yang diperiksa serta nilai yang didapatkan pada analisa kontrol tersebut. Kurva kontrol HbA2 normal terdiri dari HbA terletak di Zona 9 dan Hb A2 terletak di zona 3 Gambar 3.8 ². Universitas Sumatera Utara 26 Gambar 3.8 : Kontrol Normal HbA2 pada kapiler 1 dan kapiler 2

3.9. MASALAH

ETIKA ETHICAL CLEARANCE DAN PERSETUJUAN SETELAH PENJELASAN INFORMED CONSENT Penelitian ini dalam proses pengajuan untuk mendapatkan Ethical clearance dari Komite Penelitian Bidang Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan.

3.10. BATASAN DAN DEFENISI OPERASIONAL

 Mahasiswa Seseorang yang sedang menjalani pendidikan tinggi di sebuah universitas atau perguruan tinggi. Universitas Sumatera Utara 27  Thalassemia Thalassemia yang dimaksud disini adalah thalassemia- trait, merupakan kelainan herediter yang ditandai dengan tidak adekuatnya sintesis dari satu atau lebih rantai globin- .  MCV MCV Mean Corpuscular Volume untuk mengetahui volume eritrosit rerata. Nilai normal : 85-95 fl  MCH MCH Mean Corpuscular Hemoglobin untuk mengetahui banyaknya hemoglobin dalam satu eritrosit rerata. Nilai normal : 28-32 pg  CBC CBC Complete Blood Count untuk pemeriksaan darah lengkap, yang terdiri dari pemeriksaan hemoglobin, trombosit, leukosit , eritrosit , hematokrit dan nilai eritrosit rerata.  HbA2 HA2 Hemoglobin A2 merupakan salah satu fraksi hemoglobin yang terdapat pada manusia dewasa normal. Nilai normal HbA2: 2,2-3,2 SEBIA. Cutoff yang banyak digunakan peneliti sebagai batas atas HbA2 pada populasi sehat adalah 3,5¹ .  Minicap Elektroforesis Merupakan alat pemeriksaan elektroforesis full automatik dengan tingkat ketelitian yang baik dengan metode kapiler, memerlukan darah minimal, dapat memisahkan fraksi hemoglobin yang normal maupun abnormal. Universitas Sumatera Utara 28

3.11. KERANGKA KERJA