16
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk penelitian ekperimental murni dengan rancangan penelitian acak lengkap pola searah.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas adalah variasi konsentrasi minyak atsiri daun kemangi dan
bentuk sediaan gel anti bau kaki. b.
Variabel tergantung adalah diameter zona hambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis
dan Bacillus subtilis. c.
Variabel pengacau terkendali yaitu suhu pembiakan dan inkubasi bakteri 37
C, waktu inkubasi 24 jam, diameter sumuran 8mm, kepadatan suspensi bakteri uji setara dengan larutan standar Mc Farland 0,5
konsentrasi mikroba 1,5.10
8
CFUml, paparan sinar matahari pada saat proses destilasi dan penyimpanan fotosensitif.
d. Variabel pengacau tak terkendali adalah lingkungan tempat tumbuh
tumbuhan daun kemangi.
2. Definisi operasional
a. Minyak atsiri daun kemangi adalah minyak nabati yang mudah menguap
dan beraroma khas yang berasal dari daun kemangi Ocimum basilicum L.. Minyak atsiri diperoleh dari hasil destilasi uap dan air dengan
meletakkan daun di atas angsang alat destilasi, sehingga tidak berkontak langsung dengan air di dasar ketel.
b. Gel minyak atsiri daun kemangi adalah sediaan topikal semisolid yang
mengandung bahan aktif minyak atsiri daun kemangi kadar 15 dengan pembawa senyawa hidrofilik, yaitu carbopol yang digunakan untuk
mengurangi bau pada kaki sesuai dengan formula. c.
Diameter zona hambat adalah parameter daya antibakteri berupa diameter area jernih yang dihasilkan agen antibakteri yang sudah dikurangi dengan
diameter area jernih dari kontrol negatif dan lubang sumuran.
C. Bahan Penelitian
Daun segar daun kemangi diperoleh dari Pasar Tradisional Beringharjo Yogyakarta, aquadest, etanol 96, larutan standar Mc Farland 0.5, kultur murni
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 dan Bacillus subtilis ATCC 6633,
Mueller Hinton Agar Merck, Mueller Hinton Broth Merck, propilenglikol, carbopol 940, trietanolamin, natrium sulfat
anhidrat, dan gel Medi-Klin
®
Clindamycin phosphate 1,2.
D. Alat Penelitian
Microbiological Safety Cabinet , oven, piknometer 10 ml, hand
refractometer , autoklaf, inkubator, pH meter, vortex, alat-alat gelas, ose, neraca
analitik, mikropipet, pelubang sumuran no.4 8mm, seperangkat alat destilasi, Viscotester Riot, double plate, mixer, dan penggaris Butterfly
®
.
E. Tata Cara Penelitian
1. Identifikasi tanaman kemangi
Identifikasi tanaman
kemangi dilakukan
di Laboratorium
Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dengan mengacu pada buku panduan menurut Steenis 1975,
untuk memastikan bahwa tanaman yang digunakan benar-benar tanaman kemangi.
2. Pengumpulan daun kemangi
Daun kemangi diperoleh dari Pasar Tradisional Beringharjo, Yogyakarta. Bagian tanaman yang digunakan adalah bagian daun berwarna
hijau yang masih segar. Daun dipisahkan dari batang dan bunga, kemudian dilakukan pencucian untuk menghilangkan kotoran yang kemungkinan masih
terdapat di daun.
3. Destilasi minyak atsiri daun kemangi
Destilasi uap dan air dilakukan dengan menimbang terlebih dahulu bobot daun kemangi segar, kemudian didestilasi menggunakan air selama 4-6
jam. Daun kemangi berada di atas air dengan adanya pembatas sehingga air tidak menyentuh daun kemangi secara langsung. Kemudian uap air dan
minyak dialirkan melalui pendingin dan hasil destilasi ditampung. Destilat yang dihasilkan adalah berupa minyak dan air. Digunakan natrium sulfat
anhidrat untuk menarik air dari hasil destilat minyak atsiri, sehingga yang didapatkan adalah minyak atsiri yang murni.
4. Karakterisasi minyak atsiri daun kemangi
a. Pemeriksaan organoleptis
Pemeriksaan organoleptis minyak atsiri dilakukan dengan melihat warna, kejernihan, dan bau minyak atsiri hasil destilasi uap dan air.
Minyak kemangi memiliki warna kuning jernih, bau khas menyengat dan mudah menguap Dewi, 2008.
b. Pengukuran nilai bobot jenis minyak kemangi
Piknometer dicuci dan dibersihkan dengan air dan etanol 96. Dikeringkan dengan arus udara kering. Menimbang piknometer yang
bersih dan kering dengan seksama. Mengisi piknometer dengan air hingga penuh, lalu direndam dalam air es sehingga suhunya mencapai ± 2ºC di
bawah suhu percobaan. Kemudian piknometer dikeluarkan dan dibiarkan hingga suhu piknometer mencapai suhu ruangan, kemudian pipa kapiler
ditutup. Usap air yang menempel di dinding piknometer kemudian ditimbang dengan seksama. Melihat kerapatan air pada suhu percobaan.
Kemudian piknometer dicuci dan dibersihkan, dan digunakan untuk menghitung kerapatan minyak atsiri daun kemangi dengan cara yang sama
dengan perlakuan pada air. Di replikasi sebanyak tiga kali.
c. Pengukuran nilai indeks bias
Pengukuran indeks bias menggunakan alat hand refractometer dengan menuang sampel sebanyak 1-2 tetes pada prisma dan diarahkan
pada cahaya terang dan dilihat dengan memutar skala sampai terlihat garis batas gelap dan terang dengan jelas.
5. Identifikasi kualitatif minyak atsiri daun kemangi dengan metode KLT
Fase diam yang digunakan silika gel GF
254
dan fase gerak yang digunakan untuk daun kemangi adalah n-heksana - etilasetat 10:1 vv.
Deteksi menggunakan sinar UV 254 dan 366 nm dengan penampak bercak yang digunakan adalah vanilin asam sulfat, dengan standar eugenol.
6. Penyiapan media uji
Pembuatan media MHA yaitu mencampurkan serbuk MHA 34 g dalam aquadest 1000 ml. Pembuatan media MHB mencampurkan 21 g dalam
aquadest 1000 ml. Kemudian disterilkan dalam autoklaf 121 C pada 1 atm
selama 15 menit.
7. Uji daya antibakteri minyak atsiri daun kemangi dengan metode difusi
sumuran a.
Penyiapan larutan uji
Dari hasil destilasi dibuat berbagai variasi pengenceran dengan melarutkan minyak atsiri dengan etanol 96. Dibuat beberapa variasi
konsentrasi destilat minyak kemangi yaitu 2,5; 5; 10; 15; 20; 50 dan 100. Konsentrasi 100 minyak kemangi sebagai kontrol positif dan
etanol 96 sebagai kontrol pelarut.
b. Pembuatan suspensi bakteri
Diambil 1-3 ose kultur murni bakteri Staphylococcus epidermidis dan Bacillus subtilis, diinokulasikan ke dalam 10 ml MHB dan divortex
serta diinkubasi 37 C selama 24 jam. Dibuat suspensi bakteri sesuai
standar Mc Farland 0,5 1,5.10
8
CFUml.
c. Uji daya antibakteri minyak atsiri daun kemangi terhadap
Staphylococcus epidermidis dan Bacillus subtilis dengan difusi sumuran
Pada uji ini digunakan kontrol sterilitas media dan kontrol pertumbuhan bakteri uji. Kontrol sterilitas media ini berfungsi untuk
memastikan bahwa media yang digunakan bebas dari kontaminan. Kontrol ini dibuat dengan menuang media MHA pada cawan petri steril.
Sedangkan kontrol pertumbuhan uji berfungsi untuk melihat bakteri apakah suspensi bakteri yang digunakan dapat tumbuh dengan baik.
Pembuatan media ini dengan menambahkan bakteri uji pada media MHA kemudian dilakukan pour plate pada cawan petri steril.
Pembuatan media
untuk difusi
sumuran menggunakan
perbandingan media dengan volume 1:6. Satu bagian, yaitu 5 ml digunakan sebagai layer bawah, dituang ke dalam cawan petri steril dan
dibiarkan memadat terlebih dahulu. Enam bagian, yaitu 30 ml digunakan sebagai layer atas, yang dituang setelah media diinokulasi dengan bakteri
uji.
Pembuatan lubang sumuran pada media MHA menggunakan pelubang sumuran no. 4 dengan diameter 8 mm sebagai tempat inokulasi
variasi konsentrasi minyak atsiri, kontrol pelarut etanol 96 dan kontrol positif minyak kemangi 100. Pembuatan lubang menembus layer atas,
sedangkan layer bawah sebagai alas supaya sampel tidak menyebar ke dasar cawan petri.
Minyak atsiri dengan berbagai variasi konsentrasi diinokulasikan sebanyal 50
l dan diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37C. Saat akan diinkubasi sebelumnya cawan petri dibungkus menggunakan plastic wrab.
Daya antibakteri yang diamati berdasarkan zona hambat yang terbentuk dibandingkan kontrol pelarut etanol 96 dikurangi dengan diameter
sumuran yang digunakan 8mm. Dilakukan replikasi 3 kali.
8. Penentuan nilai KHM dan KBM dengan dilusi padat
Uji ini menggunakan tiga macam kontrol, yaitu kontrol sterilitas media, kontrol pertumbuhan bakteri, dan kontrol negatif kontrol pelarut. Kontrol
pelarut ini berfungsi untuk melihat apakah pelarut yang digunakan untuk melarutkan minyak atsiri, yaitu etanol 96 memiliki aktivitas menghambat
pertumbuhan bakteri uji atau tidak. Pembuatannya dengan cara menambahkan bakteri uji dan etanol 96 ke dalam media MHA, kemudian dilakukan pour
plate ke dalam cawan petri steril.
a. Uji daya antibakteri dengan dilusi padat
Untuk pengujian antibakteri dengan dilusi padat, variasi konsentrasi minyak kemangi didapatkan berdasarkan daya hambat yang diperoleh
pada difusi sumuran. Konsentrasi terkecil yang mempunyai aktivitas menghambat pertumbuhan bakteri pada uji dengan difusi sumuran,
konsentrasinya diturunkan dan dinaikkan untuk nantinya dapat diketahui nilai KHM dan KBM dari minyak atsiri daun kemangi.
Pembuatan suspensi dilakukan untuk kedua bakteri uji yang kekeruhannya sudah dibandingkan dengan standar Mc Farland 0,5 dan
diinkubasi selama 24 jam. Variasi konsentrasi minyak kemangi yang telah ditentukan sebanyak 1 ml bersama dengan suspensi bakteri sebanyak 1 ml
dimasukkan ke dalam cawan petri steril secara pour plate. Diinkubasikan selama 24 jam dengan suhu 37
o
C. Pertumbuhan bakteri dilihat dari kekeruhan media, semakin banyak
pertumbuhan bakteri maka media akan semakin keruh, begitu pula sebaliknya. Pembacaan hasil daya antibakteri diberi penilaian dengan
notasi +++ untuk pertumbuhan bakteri yang sangat keruh, ++ keruh, + agak keruh, dan - jernih. Kekeruhan media perlakuan dibandingkan
dengan kontrol sterilitas dan kontrol pertumbuhan.
b. Penentuan nilai KHM dan KBM
Penentuan nilai KHM dan KBM dengan melakukan streak plate dari hasil uji daya antibakteri secara dilusi padat. Media dari hasil uji
dilusi padat berbagai variasi konsentrasi yang memberikan kejernihan media secara visual, diambil 1 ose dan dilakukan streak plate pada media
MHA steril. Nilai KHM ditentukan dari konsentrasi terkecil yang menunjukkan
media jernih kemudian dilakukan streak plate dan masih terjadi pertumbuhan bakteri. Nilai KBM ditentukan dari konsentrasi terkecil yang
menunjukkan media jernih kemudian dilakukan streak plate dan tidak terjadi pertumbuhan bakteri di tempat dilakukan streak plate.
9. Pembuatan gel anti bau kaki minyak atsiri daun kemangi
Formula gel dalam 100 g Yuliani, 2005. R
Etanol 96 26,7 g
Propilenglikol 12,4 g
Larutan carbopol 3 bv 34,0 g
Aquadest 17,2 g
Trietanolamin 1,4 g
Minyak atsiri 10,0 g
Komposisi minyak atsiri daun kemangi yang dimasukkan dalam formula didapatkan dari nilai diameter zona hambat yang memberikan nilai
paling besar. Hal ini dilakukan agar daya hambat yang diberikan gel minyak kemangi adalah yang paling baik.
Dari formula tersebut di atas dilakukan modifikasi sebagai berikut:
Tabel I. Formula sediaan gel anti bau kaki minyak kemangi
Material Gel Minyak
Kemangi gram Kontrol Basis Gel Minyak
Kemangi gram
Etanol 96 24,8
29,1 Propilenglikol
11,5 13,5
Larutan carbopol 3 bv 31,5
37,1 Aquadest
15,9 18,8
Trietanolamin 1,3
1,5 Minyak atsiri
15 -
Larutan carbopol 3 bv dibuat dengan cara mengembangkan carbopol dalam aquadest yang sesuai dalam formula selama 24 jam.
Selanjutnya dicampurkan dengan propilenglikol, aquadest, etanol, minyak atsiri daun kemangi, dan trietanolamin dengan mixer sampai terbentuk sediaan
gel.
10. Uji sifat fisik sediaan gel anti bau kaki minyak atsiri daun kemangi
Pengukuran sifat fisik gel anti bau kaki minyak kemangi dilakukan 48 jam setelah pembuatan, yang meliputi:
a. Uji viskositas
Pengukuran viskositas dilakukan dengan menggunakan Viscotester Rion seri VT 04. Sebanyak 100 gram sediaan dimasukkan ke dalam wadah dan
dipasang pada portable viscotester. Viskositas diamati pada skala yang ditunjukkan jarum penunjuk setelah tercapai kestabilan.
b. Uji daya sebar
Pada satu sisi double plate berskala diletakkan 0,5 g gel dan kemudian disatukan, didiamkan selama 1 menit, diberi beban 50 g didiamkan 1
menit, diberi tambahan beban 50 g dan didiamkan 1 menit, kemudian diberi tambahan 50 g, sehingga bobot beban total 150 g, dan didiamkan 1
menit kemudian diukur diameter penyebarannya dengan melihat dari beberapa sisi.
11. Uji daya antibakteri sediaan gel anti bau kaki minyak atsiri daun
kemangi terhadap Staphylococcus epidermidis dan Bacillus subtilis dengan
metode difusi sumuran
Dibuat 6 lubang sumuran dengan diameter 8 mm pada cawan petri yang telah berisi MHA double layer. Masing-masing sumuran diisi 100 mg
gel minyak kemangi, 100 mg kontrol basis gel, 50 µl minyak kemangi 15, 100 mg kontrol positif Clindamycin phosphate gel, 50 µl kontrol negatif
etanol 96, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC. Sebelum diinkubasi, cawan petri dibungkus menggunakan plastic wrab.
F. Analisis Data
Data yang diperoleh dari penelitian ini akan dianalisis menggunakan program sofware R 2.14.1. Data yang akan dianalisis secara statistik meliputi data
diameter zona hambat minyak kemangi dan gel anti bau kaki minyak kemangi terhadap Staphylococcus epidermidis dan Bacillus subtilis, serta data pengukuran
viskositas dan daya sebar gel anti bau kaki minyak kemangi. Analisis statistik diawali dengan melihat kenormalan data yang diperoleh menggunakan uji Shapiro
Wilk . Bila data yang didapat terdistribusi normal maka dilanjutkan dengan uji
parametrik menggunakan Levene test, sedangkan bila data terdistribusi tidak normal digunakan uji non parametrik yaitu Kruskal-Wallis. Analisis data yang
telah diperoleh dilanjutkan dengan menggunakan uji Wilcoxon untuk mengetahui ada atau tidaknya perbedaan di antara data-data yang diperoleh.
27
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Identifikasi Daun Kemangi
Daun kemangi yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Pasar Tradisional Beringharjo, Yogyakarta dalam bentuk tanaman kemangi segar.
Untuk mengetahui kebenaran tentang tanaman kemangi yang digunakan dilakukan determinasi tanaman berdasarkan Steenis 1975 Lampiran 1.
Gambar 3. Daun kemangi
B. Penyiapan Bahan Daun Kemangi
Penyiapan bahan daun kemangi dilakukan dengan memilih daun kemangi yang masih segar serta memisahkan daun kemangi dari batang dan bunga. Daun
kemangi kemudian dicuci untuk menghilangkan pengotor yang kemungkinan terdapat di daun.
C. Destilasi Minyak Atsiri Daun Kemangi
Pengambilan minyak atsiri dari daun kemangi dilakukan menggunakan destilasi metode uap dan air. Destilasi uap dan air digunakan karena daun
kemangi rusak saat pendidihan langsung menggunakan air dan mudah menguap.
Kategori