D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT
1. Definisi
KCKT atau disebut juga HPLC High Performance Liquid Chromatography
adalah teknik analisis kuantitatif dengan cara memisahkan dan menganalisis analit dari komponen lain dalam matriks sampel dengan bantuan
kolom sebagai fase diam dan cairan sebagai fase gerak Snyder, Kirkland, dan Dolan, 2010. KCKT merupakan teknik analisis kuantitatif yang paling banyak
digunakan untuk analisis kuantitatif obat-obatan, biomolekul, polimer, dan senyawa organik lain Ahuja dan Dong, 2005.
2. Instrumentasi
Mekanisme kerja KCKT adalah sampel dimasukan ke dalam tempat injeksi yang menuju kolom kromatografi. Fase gerak menuju kolom dengan
bantuan pompa, zat-zat terlarut akan terpisah karena adanya interaksi yang bebeda antara komponen dalam sampel dengan fase gerak dan fase diam yang berada di
dalam kolom. Zat-zat terlarut yang sudah terpisah meninggalkan kolom dan akan terdeteksi oleh detektor. Hasil yang diperoleh dari proses tersebut adalah
kromatogram yang terdiri dari signal detektor dan waktu Snyder dkk., 2010. Instrumetasi dari KCKT terdiri dari beberapa komponen, yaitu wadah fase gerak,
pompa, tempat sampel, kolom, dan detektor seperti terlihat pada gambar 2 Gandjar dan Rohman, 2007.
Gambar 2. Sistem intrumen pada KCKT Snyder dkk., 2010
a. Wadah fase gerak. Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Fase gerak
sebelum digunakan harus disaring dan di-degassing terlebih dahulu, dengan tujuan untuk menghilangkan pengotor dan gas yang dapat menyumbat
kolom sehingga mengacaukan analisis. Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat fase gerak disarankan memiliki kemurnian yang sangat tinggi atau
berstandar KCKT HPLC grade Gandjar dan Rohman, 2007. b.
Fase gerak. Fase gerak biasanya terdiri dari beberapa campuran pelarut sehingga nantinya memiliki daya elusi dan resolusi yang diinginkan. Daya
elusi dan resolusi tersebut ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel Snyder dkk.,
2010. Fase gerak yang digunakan pada KCKT fase terbalik HPLC-RP adalah
fase gerak yang bersifat lebih polar dibanding fase diam. Contoh fase gerak yang paling sering digunakan dalam KCKT fase terbalik adalah campuran
larutan buffer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril, atau campuran metanol dengan asetonitril Gandjar dan Rohman, 2007. Hal-hal
yang perlu dipertimbangkan dalam pemilihan fase gerak, yaitu polaritas, kelarutan sampel, stabilitas, pH, dan kompatibilitas antar pelarut. Selain itu,
fase gerak harus dapat tercampur dengan baik dan tidak terdapat endapan apabila terdiri dari campuran beberapa pelarut Kazakevich dan Lobrutto,
2007. c.
Pompa. Pompa yang digunakan untuk KCKT harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umumnya digunakan untuk pompa, yaitu gelas , baja
tahan karat, teflon, dan batu nilam. Tujuan dari penggunaan pompa dalam KCKT adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung
konstan dan reprodusibel, tepat, dan bebas gangguan Snyder dkk., 2010. d.
Kolom. Kolom merupakan bagian yang sangat penting dalam pemisahan komponen-komponen sampel yang terdapat fase diam di dalamnya.
Oktadesilsilan C18 dan oktilsilika C8 merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan
kepolaran rendah, sedang maupun tinggi Gandjar dan Rohman, 2007. e.
Detektor. Detektor pada KCKT digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu detektor universal misalnya detektor indeks bias dan detektor
spektrofotometri massa dan detektor yang spesifik misalnya detektor UV- Vis, detektor fluoresensi, dan detektor elektrokimia. Detektor yang paling
sering digunkan adalah detektor UV-Vis. Cara kerja detektor ini didasarkan atas penyerapan radiasi ultraviolet dan sinar tampak pada kisaran panjang
gelombang 190-800 nm oleh molekul yang memiliki struktur atau gugus kromoforik Snyder dkk., 2010.
E. Validasi Metode Analisis
Kategori