UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
amplifikasi yang menunjukkan tiga fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial atau puncak dan fasa plateau atau stabil Vaerman, 2004.
Gambar 2.14. Bentuk Kurva Real-Time PCR Sumber: bio-rad.com
2.6.1. Pewarna Fluoresensi
Real-time PCR menggunakan pewarna fluoresensi dan probe dengan fluoresensi. Probe berupa oligonukleotida yang tersusun dari sekuen
spesifik dan akan berpasangan dengan sekuen DNA cetakan yang akan diamplifikasi. Macam-macam fluoresensi yang umumnya digunakan
antara lain SYBR Green, Hydrolysis probes, Hybridization probes, dan Molecular beacons. Fluoresensi akan berpendar hijau saat berikatan
dengan DNA cetakan Kubista et al., 2006. Pewarna yang umum digunakan adalah SYBR Green dan Hydrolysis Probe.
a. Hydrolysis Probe
Hydrolisis probe menggunakan oligonukleotida spesifik yang berkomplemen dengan DNA target disebut Probe. Probe dilabeli
oleh dua molekul, yaitu reporter pada ujung 5’ probe yang
merupakan pewarna fluoresensi dan quencer pada ujung 3’ probe
yang merupakan molekul penerima sinyal fluoresensi. Hydrolysis probe memiliki prinsip kerja, yaitu saat probe belum
berkomplemen dengan DNA target, molekul reporter akan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
mengeksitasikan sinyal fluoresensi ke molekul quencer karena jarak antara kedua molekul berdekatan. Probe akan berkomplemen
dengan DNA target saat mencapai suhu annealing, lalu mekanisme eksitasi sinyal fluoresensi dari reporter ke quencer terhenti karena
jarak kedua molekul berjauhan. DNA polimerase akan mengelongasi DNA target sampai DNA polimerase dan probe
berdekatan maka 5’nuklease yang terdapat pada DNA polimerase akan menghidrolisis molekul reporter sehingga emisi sinyal
fluoresensi dapat tertangkap oleh detektor pada Real Time PCR Shipley, 2007. Hydrolysis probe biasa digunakan dalam multiplex
pada qRT PCR yang menggunakan DNA target dan pasangan primer lebih dari satu dalam satu reaksi karena probe akan
berikatan secara spesifik dengan beberapa DNA target yang berbeda BioRad, 2006.
b. SYBR Green
Prinsip dari SYBR Green adalah pewarna fluoresensi akan mengikat bagian minor dari untai ganda DNA sehingga menghasilkan
pendaran warna hijau pada akhir fase extension selama proses Real Time PCR berlangsung Shipley, 2007. Intensitas fluoresensi yang
semakin tinggi meenunjukkan peningkatan jumlah untai ganda DNA yang terdeteksi oleh detektor. Intensitas fluoresensi yang
akan dihitung dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif pada qRT PCR. SYBR Green umumnya digunakan dalam singleplex
pada Real Time PCR yang menggunakan satu DNA target dan sepasang primer. SYBR Green lebih sering digunakan dibandingkan
Hydrolisis probe karena memiliki beberapa keunggulan, yaitu dapat digunakan untuk beberapa pengujian karena mampu bekerja
pada semua jenis primer, teknik pengujian lebih sederhana karena tidak perlu merancang probe, dan harga pewarna fluoresensi yang
relatif lebih rendah Shipley, 2007. SYBR Green memiliki kelemahan, yaitu SYBR Green dapat mengikat DNA untai ganda
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
pada bagian tidak spesifik sehingga primer-dimer juga akan diikat oleh SYBR Green. Namun, produk tidak spesifik dapat dianalisis
keberadaannya dalam analisis melting curve Valasek Repa ,2005; Kubista et al., 2006.
Gambar 2.16. Mekanisme Hydrolysis Probe dan SYBR Green
Sumber: Thermoscientificbio.com
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1 Tempat
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisis Obat Pangan Halal; Laboratorium Penelitian 2; dan Laboratorium Biokimia Patologi
Klinis. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.1.2 Waktu
Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan pada bulan Maret 2014 hingga September 2014.
3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat
Real Time PCR Light Cycler® 480 - Roche, Multiwell Plate 96 Roche, Sealing Foil Roche, Mikropipet 0.5-
10 μl Biorad, Mikropipet 2-
20 μl Biorad, Mikropipet 20-200 μl Biorad, Mikropipet 100-1000 μl Biorad, Micro
tips volume 10 μl; 200 μl; dan 1000 μl Genfollower, Spektrofotometri UV DNA BioDrop, Gel Documentation AE-6933
ATTO, satu set alat Elektroforesis Agarosa Biorad, Digital Waterbath SB-100 Eyela, Vortex, Sentrifugator 5417R
– Eppendorf, Filter Tube dan Collection Tube Kit High Pure PCR Template Preparation
– Roche, plastic wrap, alumunium foil, Microsentrifuge tube volume 1,5 ml
Biogenix, pisau steril, kaca arloji, erlenmeyer 50 ml, dan spatula.
3.2.2 Bahan
Daging sapi segar, daging babi segar, gelatin sapi Sigma Aldrich, gelatin babi Sigma Aldrich, Tris Base SBS Genetech, asam asetat
glasial Merck, EDTA Merck, satu set reagen isolasi DNA meliputi Tissue Lysis Buffer; Binding Buffer; Proteinase K; Inhibitor Removal
Buffer; Washing Buffer; dan Elution Buffer Kit High Pure PCR Template
26