Pewarna Fluoresensi Real-Time PCR

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta amplifikasi yang menunjukkan tiga fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial atau puncak dan fasa plateau atau stabil Vaerman, 2004. Gambar 2.14. Bentuk Kurva Real-Time PCR Sumber: bio-rad.com

2.6.1. Pewarna Fluoresensi

Real-time PCR menggunakan pewarna fluoresensi dan probe dengan fluoresensi. Probe berupa oligonukleotida yang tersusun dari sekuen spesifik dan akan berpasangan dengan sekuen DNA cetakan yang akan diamplifikasi. Macam-macam fluoresensi yang umumnya digunakan antara lain SYBR Green, Hydrolysis probes, Hybridization probes, dan Molecular beacons. Fluoresensi akan berpendar hijau saat berikatan dengan DNA cetakan Kubista et al., 2006. Pewarna yang umum digunakan adalah SYBR Green dan Hydrolysis Probe. a. Hydrolysis Probe Hydrolisis probe menggunakan oligonukleotida spesifik yang berkomplemen dengan DNA target disebut Probe. Probe dilabeli oleh dua molekul, yaitu reporter pada ujung 5’ probe yang merupakan pewarna fluoresensi dan quencer pada ujung 3’ probe yang merupakan molekul penerima sinyal fluoresensi. Hydrolysis probe memiliki prinsip kerja, yaitu saat probe belum berkomplemen dengan DNA target, molekul reporter akan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta mengeksitasikan sinyal fluoresensi ke molekul quencer karena jarak antara kedua molekul berdekatan. Probe akan berkomplemen dengan DNA target saat mencapai suhu annealing, lalu mekanisme eksitasi sinyal fluoresensi dari reporter ke quencer terhenti karena jarak kedua molekul berjauhan. DNA polimerase akan mengelongasi DNA target sampai DNA polimerase dan probe berdekatan maka 5’nuklease yang terdapat pada DNA polimerase akan menghidrolisis molekul reporter sehingga emisi sinyal fluoresensi dapat tertangkap oleh detektor pada Real Time PCR Shipley, 2007. Hydrolysis probe biasa digunakan dalam multiplex pada qRT PCR yang menggunakan DNA target dan pasangan primer lebih dari satu dalam satu reaksi karena probe akan berikatan secara spesifik dengan beberapa DNA target yang berbeda BioRad, 2006. b. SYBR Green Prinsip dari SYBR Green adalah pewarna fluoresensi akan mengikat bagian minor dari untai ganda DNA sehingga menghasilkan pendaran warna hijau pada akhir fase extension selama proses Real Time PCR berlangsung Shipley, 2007. Intensitas fluoresensi yang semakin tinggi meenunjukkan peningkatan jumlah untai ganda DNA yang terdeteksi oleh detektor. Intensitas fluoresensi yang akan dihitung dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif pada qRT PCR. SYBR Green umumnya digunakan dalam singleplex pada Real Time PCR yang menggunakan satu DNA target dan sepasang primer. SYBR Green lebih sering digunakan dibandingkan Hydrolisis probe karena memiliki beberapa keunggulan, yaitu dapat digunakan untuk beberapa pengujian karena mampu bekerja pada semua jenis primer, teknik pengujian lebih sederhana karena tidak perlu merancang probe, dan harga pewarna fluoresensi yang relatif lebih rendah Shipley, 2007. SYBR Green memiliki kelemahan, yaitu SYBR Green dapat mengikat DNA untai ganda UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pada bagian tidak spesifik sehingga primer-dimer juga akan diikat oleh SYBR Green. Namun, produk tidak spesifik dapat dianalisis keberadaannya dalam analisis melting curve Valasek Repa ,2005; Kubista et al., 2006. Gambar 2.16. Mekanisme Hydrolysis Probe dan SYBR Green Sumber: Thermoscientificbio.com UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1 Tempat Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisis Obat Pangan Halal; Laboratorium Penelitian 2; dan Laboratorium Biokimia Patologi Klinis. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.1.2 Waktu

Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan pada bulan Maret 2014 hingga September 2014. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Real Time PCR Light Cycler® 480 - Roche, Multiwell Plate 96 Roche, Sealing Foil Roche, Mikropipet 0.5- 10 μl Biorad, Mikropipet 2- 20 μl Biorad, Mikropipet 20-200 μl Biorad, Mikropipet 100-1000 μl Biorad, Micro tips volume 10 μl; 200 μl; dan 1000 μl Genfollower, Spektrofotometri UV DNA BioDrop, Gel Documentation AE-6933 ATTO, satu set alat Elektroforesis Agarosa Biorad, Digital Waterbath SB-100 Eyela, Vortex, Sentrifugator 5417R – Eppendorf, Filter Tube dan Collection Tube Kit High Pure PCR Template Preparation – Roche, plastic wrap, alumunium foil, Microsentrifuge tube volume 1,5 ml Biogenix, pisau steril, kaca arloji, erlenmeyer 50 ml, dan spatula.

3.2.2 Bahan

Daging sapi segar, daging babi segar, gelatin sapi Sigma Aldrich, gelatin babi Sigma Aldrich, Tris Base SBS Genetech, asam asetat glasial Merck, EDTA Merck, satu set reagen isolasi DNA meliputi Tissue Lysis Buffer; Binding Buffer; Proteinase K; Inhibitor Removal Buffer; Washing Buffer; dan Elution Buffer Kit High Pure PCR Template 26

Dokumen yang terkait

Perbandingan Metode Kit Komersial dan SDS untuk Isolasi DNA Babi dan DNA Sapi dari Simulasi Cangkang Kapsul Keras untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain reaction)

2 12 82

Analisis Cemaran Daging Babi Pada Kornet Sapi di Wilayah Ciputat dengan Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)

3 16 72

Deteksi DNA Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

1 9 66

Deteksi DNA Gelatin Sapi Dan Gelatin Babi Pada Simulasi Gummy Vitamin C Menggunakan Real -Time PCR Untuk Analisis Kehalalan

1 11 70

Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Bakso Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Real- Time Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan Metode Hydrolysis Probe.

1 51 86

Perbandingan antara metode SYBR green dan metode hydrolysis probe dalam analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi dengan menggunakan real time PCR

1 33 90

Amplifikasi DNA Leptospira dengan menggunakan metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

2 24 64

Analisis Kandungan Gelatin Babi dan Gelatin Sapi pada Cangkang Kapsul Keras yang Mengandung Vitamin A Menggunakan Real-Time Polymerase Chain Reaction

0 13 80

Perbandingan metode KIT komersial dan SDS untuk isolasi DNA babi dan DNA sapi pada simulasi cangkang kapsul keras untuk deteksi kehalalan menggunakan real-time PCR (polymerase chain reaction)

0 12 82

Perbandingan Metode SYBR Green dan Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan Babi Menggunakan Real Time PCR

0 0 8