UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.3 Ekstraksi dan Isolasi DNA
Prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNA dari komponen- komponen sel. Isolasi DNA dari organisme eukariotik dilakukan melalui
proses penghancuran membran sel lisis, pemisahan DNA dari protein sel, dan purifikasi DNA Muladno, 2010. Berikut adalah uraian tahapan isolasi
DNA: 1.
Penghancuran Membran Sel lisis Untuk mendapatkan DNA, membran terlebih dahulu dilisiskan dengan
senyawa kimia seperti lisozim, EDTA, dan SDS. Lisozim merupakan enzim yang dapat memakan dinding sel. Penggunaan Lisozim biasanya
untuk ekstraksi dan isolasi DNA dari sel tumbuhan. EDTA merupakan zat yang dapat merusak membran sel dengan cara mengikat ion Mg
2+
yang berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat.
SDS sodium dodesil sulfat merupakan detergent yang dapat merusak integritas membran sel dengan cara mengikat lipid yang terdapat pada
membran sel. Larutan pelisis sel umumnya terdiri atas satu atau lebih detergent seperti SDS, NP-40, atau Triton X-100. Sel debris yang
ditimbulkan akibat cairan pelisis dilakukan setrifugasi sehingga hanya tertinggal molekul nukleotida.
2. Pemisahan DNA dari Protein Sel
Protein pada sel dihancurkan dengan bantuan enzim proteinase K. Enzim ini dapat memecahkan protein histon sehingga DNA terurai.
Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan fenol untuk mengikat protein dan sebagian kecil RNA dan kloroform untuk
membersihkan protein dan polisakarida dari larutan. Umumnya ditambahkan
dengan perbandingan
1:1. Kemudian
dilakukan sentifugasi kembali untuk mengendapkan molekul yang berat, dan
dipisahkan DNA yang berada pada supernatant. 3.
Purifikasi DNA DNA yang telah dibersihkan dari protein masih tercampur dengan
RNA. Untuk membersihkan molekul RNA dari larutan, enzim RNAse
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
digunakan untuk mendegradasi molekul RNA. Dengan hilangnya protein dan RNA, maka DNA dapat diisolasi secara utuh. Molekul
DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan cara presipitasi menggunakan etanol absolut dan larutan garam. Dengan
adanya larutan garam kation monovalen seperti Na
+
, pada suhu -20
o
C etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik sehingga mudah
dipisahkan dengan cara sentrifugasi.
Gambar 2.9. Presipitasi DNA setelah Penambahan Etanol Absolut
Sumber: www.learn.genetics.utah.edu Pada umumnya isolasi DNA dengan metode konvensional yang
dijelaskan sebelumnya cukup melelahkan karena membutuhkan waktu hingga beberapa jam bahkan beberapa hari. Selain itu, berkembang pesatnya
kebutuhan di bidang diagnostik molelular dan filogeni molekular yang menuntut kecepatan, prosedur yang sederhana, hasil yang akurat dalam
ekstraksi DNA dari berbagai jenis sampel, menciptakan pengembangan teknologi baru untuk pengektraksian DNA yang mudah dan lebih cepat dari
sebelumnya. Salah satu pengembangan teknik purifikasi DNA adalah dengan
bantuan spin column yang mengandung silicon dioxide sebagai filter yang dapat mengabsorpsi asam nukleat Chee Tan dan Chin Yiap, 2009. Prinsip
ekstraksi dan isolasi DNA dengan metode ini adalah berdasarkan tingginya afinitas muatan negatif dari rantai utama DNA terhadap partikel silika yang
bermuatan positif. DNA dapat terikat dengan kuat pada silika dibawah
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
kondisi garam chaotropic seperti Guanidine-HCl. Garam ini dapat memecah ikatan hidrogen antara ion oksigen pada DNA dengan ion hidrogen pada air.
DNA yang terabsorpsi oleh silika dapat dipisahkan dari protein dan sel debris dengan pencucian. DNA murni kemudian dapat dielusi dari silika dengan
buffer Tris-EDTA atau Aquabidest Gjerse et al., 2009.
2.4 Elektroforesis Gel Agarosa
Kategori