Amplifikasi DNA dengan Metode SYBR Green

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.2.2 Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV

Pada sistem layar, p anel “Nucleic Acid” dipilih untuk penentuan konsentrasi dan kemurnian DNA. Sample port dibersihkan dengan tisu steril. Sebanyak 2 μL Elution Buffer ditaruh di atas Sample port dan dianalisis sebagai blangko. Sample port kembali dibersihkan dengan tisu steril. Identitas sampel dimasukkan pada kolom Sampel ID dan sebanyak 2 μL DNA sampel tersebut ditaruh di atas Sample port. Kemudian tombol ”Measure” diklik. DNA dianalis pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Hasil instrumentasi akan didapatkan data konsentrasi DNA dalam ngμl dan kemurnian DNA dengan perbandingan rasio A280 dan A260. Biodrop, 2012

3.3.3 Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI

Uji spesifisitas primer dan probe dilakukan dengan melakukan BLAST melalui database NCBI. Pada halaman “BLAST”, dipilih menu “nucleotide blast”. Kemudian pada kolom “Enter Query Sequence” dimasukkan urutan basa primer yang akan diuji . Tombol “BLAST” kemudian diklik. Data hasil pengujian berupa daftar spesies yang memiliki kemiripan 99-100 dengan urutan basa primer yang diuji NCBI.

3.3.4 Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR

3.3.4.1. Amplifikasi DNA dengan Metode SYBR Green

a. Pembuatan Larutan Primer 10 μM dari Larutan Induk Primer 100 μM Sebanyak 10 μL larutan induk primer 100 μM dimasukkan ke dalam Microsentrifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ke dalam tube tesebut ditambahkan 90 μL aquadest. Larutan tersebut dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas pada mikropipet. b. Pembuatan SYBR Green Mastermix Roche c , 2005 Mastermix dibuat dengan volume total 20 μL yang terdiri dari 5 μL DNA yang diuji; 3 μL Aquabidest; 1 μL primer forward 10 μM; 1 μL primer reverse 10 μM; dan 10 μL LightCycler® 480 SYBR Green I UIN Syarif Hidayatullah Jakarta master enzim Taq DNA Polymerase, SYBR Green 1, dNTP mix, dan 6,4 mM MgCl 2 . c. Loading Sampel dan SYBR Green Master Mix ke dalam Multiwell Plate Roche c , 2005 Sebanyak 5 μL DNA yang akan diuji dan 15 μL Mastermix dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan. Campuran dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas mikropipet secara perlahan. Multiwell plate kemudian ditutup dengan sealing foil. d. Pengaturan Program Proses Amplifikasi Roche c , 2005 dengan modifikasi Pengaturan program LightCycler® 480 Real-Time PCR yang akan digunakan untuk proses amplifikasi, dilakukan dengan percobaan sebagai berikut: Tabel 4. Pengaturan program amplifikasi dengan metode SYBR Green Analisis dengan Primer Sapi Perc. 1 Jumlah Siklus Suhu Waktu Pre Incubation 1 Siklus 95 o C 10 menit Amplification 45 siklus 95 o C 60 o C 72 o C 10 detik 20 detik 30 detik Melting Curve Analysis 1 Siklus 95 o C 60 o C 97 o C5 o C 5 detik 1 menit - Cooling 1 Siklus 40 o C 10 detik Perc. 2 Jumlah Siklus Suhu Waktu Pre Incubation 1 Siklus 95 o C 10 menit Amplification 45 siklus 95 o C 62 o C 72 o C 10 detik 20 detik 30 detik Melting Curve Analysis 1 Siklus 95 o C 60 o C 97 o C5 o C 5 detik 1 menit - Cooling 1 Siklus 40 o C 10 detik Perc. 3 Jumlah Siklus Suhu Waktu UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Pre Incubation 1 Siklus 95 o C 10 menit Amplification 45 siklus 95 o C 64 o C 72 o C 10 detik 20 detik 30 detik Melting Curve Analysis 1 Siklus 95 o C 60 o C 97 o C5 o C 5 detik 1 menit - Cooling 1 Siklus 40 o C 10 detik Perc. 4 Jumlah Siklus Suhu Waktu Pre Incubation 1 Siklus 95 o C 10 menit Amplification 45 siklus 95 o C 65 o C 72 o C 10 detik 20 detik 30 detik Melting Curve Analysis 1 Siklus 95 o C 60 o C 97 o C5 o C 5 detik 1 menit - Cooling 1 Siklus 40 o C 10 detik Analisis dengan Primer Babi Perc. 1 Jumlah Siklus Suhu Waktu Pre Incubation 1 Siklus 95 o C 10 menit Amplification 45 siklus 95 o C 60 o C 72 o C 10 detik 10 detik 7 detik Melting Curve Analysis 1 Siklus 95 o C 60 o C 97 o C5 o C 5 detik 1 menit - Cooling 1 Siklus 40 o C 10 detik Perc. 2 Jumlah Siklus Suhu Waktu Pre Incubation 1 Siklus 95 o C 10 menit Amplification 45 siklus 95 o C 60 o C 72 o C 10 detik 20 detik 30 detik Melting Curve Analysis 1 Siklus 95 o C 5 detik UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 60 o C 97 o C5 o C 1 menit - Cooling 1 Siklus 40 o C 10 detik Perc. 3 Jumlah Siklus Suhu Waktu Pre Incubation 1 Siklus 95 o C 10 menit Amplification 45 siklus 95 o C 60 o C 72 o C 10 detik 20 detik 25 detik Melting Curve Analysis 1 Siklus 95 o C 60 o C 97 o C5 o C 5 detik 1 menit - Cooling 1 Siklus 40 o C 10 detik Keterangan: = Modifikasi yang dilakukan pada proses amplifikasi Real Time PCR

3.3.4.2. Amplifikasi DNA dengan Metode Hydrolysis Probe

Dokumen yang terkait

Perbandingan Metode Kit Komersial dan SDS untuk Isolasi DNA Babi dan DNA Sapi dari Simulasi Cangkang Kapsul Keras untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain reaction)

2 12 82

Analisis Cemaran Daging Babi Pada Kornet Sapi di Wilayah Ciputat dengan Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)

3 16 72

Deteksi DNA Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

1 9 66

Deteksi DNA Gelatin Sapi Dan Gelatin Babi Pada Simulasi Gummy Vitamin C Menggunakan Real -Time PCR Untuk Analisis Kehalalan

1 11 70

Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Bakso Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Real- Time Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan Metode Hydrolysis Probe.

1 51 86

Perbandingan antara metode SYBR green dan metode hydrolysis probe dalam analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi dengan menggunakan real time PCR

1 33 90

Amplifikasi DNA Leptospira dengan menggunakan metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

2 24 64

Analisis Kandungan Gelatin Babi dan Gelatin Sapi pada Cangkang Kapsul Keras yang Mengandung Vitamin A Menggunakan Real-Time Polymerase Chain Reaction

0 13 80

Perbandingan metode KIT komersial dan SDS untuk isolasi DNA babi dan DNA sapi pada simulasi cangkang kapsul keras untuk deteksi kehalalan menggunakan real-time PCR (polymerase chain reaction)

0 12 82

Perbandingan Metode SYBR Green dan Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan Babi Menggunakan Real Time PCR

0 0 8