UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.2.2 Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV
Pada sistem layar, p anel “Nucleic Acid” dipilih untuk penentuan
konsentrasi dan kemurnian DNA. Sample port dibersihkan dengan tisu steril. Sebanyak 2 μL Elution Buffer ditaruh di atas Sample port dan
dianalisis sebagai blangko. Sample port kembali dibersihkan dengan tisu steril. Identitas sampel dimasukkan pada kolom Sampel ID dan sebanyak 2
μL DNA sampel tersebut ditaruh di atas Sample port. Kemudian tombol ”Measure” diklik. DNA dianalis pada panjang gelombang 260 nm dan 280
nm. Hasil instrumentasi akan didapatkan data konsentrasi DNA dalam ngμl
dan kemurnian DNA dengan perbandingan rasio A280 dan A260. Biodrop, 2012
3.3.3 Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI
Uji spesifisitas primer dan probe dilakukan dengan melakukan BLAST melalui database
NCBI. Pada halaman “BLAST”, dipilih menu “nucleotide blast”. Kemudian pada kolom “Enter Query Sequence”
dimasukkan urutan basa primer yang akan diuji . Tombol “BLAST”
kemudian diklik. Data hasil pengujian berupa daftar spesies yang memiliki kemiripan 99-100 dengan urutan basa primer yang diuji NCBI.
3.3.4 Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR
3.3.4.1. Amplifikasi DNA dengan Metode SYBR Green
a. Pembuatan Larutan Primer 10
μM dari Larutan Induk Primer 100 μM
Sebanyak 10 μL larutan induk primer 100 μM dimasukkan ke
dalam Microsentrifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ke dalam tube tesebut ditambahkan
90 μL aquadest. Larutan tersebut dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas pada mikropipet.
b. Pembuatan SYBR Green Mastermix Roche
c
, 2005
Mastermix dibuat dengan volume total 20 μL yang terdiri dari 5 μL
DNA yang diuji; 3 μL Aquabidest; 1 μL primer forward 10 μM; 1 μL
primer reverse 10 μM; dan 10 μL LightCycler® 480 SYBR Green I
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
master enzim Taq DNA Polymerase, SYBR Green 1, dNTP mix, dan 6,4 mM MgCl
2
. c.
Loading Sampel dan SYBR Green Master Mix ke dalam Multiwell Plate Roche
c
, 2005 Sebanyak
5 μL DNA yang akan diuji dan 15 μL Mastermix dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan.
Campuran dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas mikropipet secara perlahan. Multiwell plate kemudian ditutup dengan sealing foil.
d. Pengaturan Program Proses Amplifikasi Roche
c
, 2005 dengan modifikasi
Pengaturan program LightCycler® 480 Real-Time PCR yang akan digunakan untuk proses amplifikasi, dilakukan dengan percobaan sebagai
berikut:
Tabel 4. Pengaturan program amplifikasi dengan metode SYBR Green
Analisis dengan Primer Sapi Perc. 1
Jumlah Siklus Suhu
Waktu
Pre Incubation 1 Siklus
95
o
C 10 menit
Amplification 45 siklus
95
o
C 60
o
C 72
o
C 10 detik
20 detik 30 detik
Melting Curve Analysis
1 Siklus 95
o
C 60
o
C 97
o
C5
o
C 5 detik
1 menit -
Cooling 1 Siklus
40
o
C 10 detik
Perc. 2 Jumlah Siklus
Suhu Waktu
Pre Incubation 1 Siklus
95
o
C 10 menit
Amplification 45 siklus
95
o
C 62
o
C 72
o
C 10 detik
20 detik 30 detik
Melting Curve Analysis
1 Siklus 95
o
C 60
o
C 97
o
C5
o
C 5 detik
1 menit -
Cooling 1 Siklus
40
o
C 10 detik
Perc. 3 Jumlah Siklus
Suhu Waktu
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pre Incubation 1 Siklus
95
o
C 10 menit
Amplification 45 siklus
95
o
C 64
o
C 72
o
C 10 detik
20 detik 30 detik
Melting Curve Analysis
1 Siklus 95
o
C 60
o
C 97
o
C5
o
C 5 detik
1 menit -
Cooling 1 Siklus
40
o
C 10 detik
Perc. 4 Jumlah Siklus
Suhu Waktu
Pre Incubation 1 Siklus
95
o
C 10 menit
Amplification 45 siklus
95
o
C 65
o
C 72
o
C 10 detik
20 detik 30 detik
Melting Curve Analysis
1 Siklus 95
o
C 60
o
C 97
o
C5
o
C 5 detik
1 menit -
Cooling 1 Siklus
40
o
C 10 detik
Analisis dengan Primer Babi Perc. 1
Jumlah Siklus Suhu Waktu
Pre Incubation 1 Siklus
95
o
C 10 menit
Amplification 45 siklus
95
o
C 60
o
C 72
o
C 10 detik
10 detik 7 detik
Melting Curve Analysis
1 Siklus 95
o
C 60
o
C 97
o
C5
o
C 5 detik
1 menit -
Cooling 1 Siklus
40
o
C 10 detik
Perc. 2 Jumlah Siklus
Suhu Waktu
Pre Incubation 1 Siklus
95
o
C 10 menit
Amplification 45 siklus
95
o
C 60
o
C 72
o
C 10 detik
20 detik 30 detik
Melting Curve Analysis
1 Siklus 95
o
C 5 detik
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
60
o
C 97
o
C5
o
C 1 menit
- Cooling
1 Siklus 40
o
C 10 detik
Perc. 3 Jumlah Siklus
Suhu Waktu
Pre Incubation 1 Siklus
95
o
C 10 menit
Amplification 45 siklus
95
o
C 60
o
C 72
o
C 10 detik
20 detik 25 detik
Melting Curve Analysis
1 Siklus 95
o
C 60
o
C 97
o
C5
o
C 5 detik
1 menit -
Cooling 1 Siklus
40
o
C 10 detik
Keterangan: = Modifikasi yang dilakukan pada proses amplifikasi
Real Time PCR
3.3.4.2. Amplifikasi DNA dengan Metode Hydrolysis Probe