UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
menjadi teknik utama dalam laboratorium biologi molekuler, antara lain untuk transkripsi in vitro dari PCR template, PCR rekombinan, DNAse I
footprinting, sequencing dengan bantuan phage promoters, dan sebagainya Putra, 1999.
Teknik ini memungkinkan adanya amplifikasi antara dua region DNA yang diketahui, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu
memasukkannya ke dalam sel in vivo. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diamplifikasi merupakan DNA untai tunggal yang
urutannya komplemen dengan DNA template-nya. Amplifikasi ini dapat menghasilkan lebih dari satu kali DNA asli.
2.5.2 Tahapan PCR
Menurut Sambrook et al., 2001, tahapan yang terjadi dalam proses amplifikasi DNA pada PCR yaitu pemisahan denaturasi rantai DNA
template, penempelan annealing pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan extension primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis
oleh DNA polimerase.
Gambar 2.12. Tahapan Proses PCR Sumber: www.bioserv.fiu.edu
1. Denaturasi DNA template
Pada tahap ini, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90-
95
o
C selama 3 menit untuk meyakinkan bahwa molekul DNA target yang ingin dilipat gandakan jumlahnya benar-benar telah
terdenaturasi menjadi untai tunggal. Untuk denaturasi berikutnya, waktu yang diperlukan hanya 30 detik pada suhu 95
o
C atau 15 detik pada suhu 97
o
C. Suhu denaturasi dipengaruhi oleh sekuen DNA target. Jika
DNA target kaya akan G-C maka diperlukan suhu yang lebih tinggi, hal ini dikarenakan ikatan hidrogen pada G-C lebih banyak
dibandingkan ikatan A-T. Selain itu, suhu denaturasi juga tidak boleh terlalu tinggi dan waktu denaturasi yang terlalu lama, karena
dapat mengakibatkan hilangnya atau berkurangnya aktivitas enzim Taq polymerase.
2. Penempelan Primer annealing
Primer akan menuju daerah yang spesifik, dimana daerah tersebut memiliki komplemen dengan primernya. Pada proses
annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk. Selanjutnya, enzim Taq DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen
tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50-60
o
C. Spesifisitas PCR sangat tergantung pada suhu melting T
m
primer, yaitu suhu dimana separuh jumlah primer menempel pada template.
Temperatur penempelan yang digunakan biasanya 5
o
C di bawah Tm, dimana formula untuk menghitung Tm = 4
o
C G+C + 2
o
C A+T. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi
temperaturnya. 3.
Reaksi polimerisasi extension Primer yang telah menempel tadi akan mengalami
perpanjangan pada sisi 3 nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan template oleh DNA polimerase. Umumnya
reaksi polimerisasi extension atau perpanjangan rantai, terjadi
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
pada suhu 72
o
C karena merupakan suhu optimum Taq polymerase. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu
72
o
C diperkirakan antara 35 sampai 100 nukleotida per detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam, dan molekul DNA
target. Dengan demikian, untuk produk PCR sepanjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap
pemanjangan primer ini.
Ketiga tahapan tersebut terjadi dalam satu siklus. Produk DNA pada siklus amplifikasi pertama akan menjadi cetakan pada siklus berikutnya.
Produk yang dihasilkan bersifat eksponensial 2
n
, dengan n adalah jumlah siklus yang dilakukan Keller dan Manak, 1989. Ini mengakibatkan PCR
sangat efektif karena dapat menghasilkan DNA dalam jumlah mikrogram dari jumlah DNA awal dalam pikogram Zyskind dan Bernstain, 1992.
Gambar 2.13. Pelipatgandaan Molekul DNA Target
Sumber: www.bioserv.fiu.edu 2.5.3 Komponen PCR
Beberapa komponen penting yang dibutuhkan dalam PCR adalah DNA template, primer, enzim Taq DNA Polymerase, deoxyribonucleaside
triphosphate dNTP’s, dan buffer PCR. DNA template merupakan DNA
yang akan diamplifikasi, dapat berupa untai tunggal atau untai ganda. Primer yang digunakkan sebaiknya berukuran 20-26 pasang basa, dengan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
komposisi 50-60 C+G, sekuens DNA kedua primer tidak saling berkomplemen yang akan menyebabkan terjadinya penempelan antar
primer primer-dimer, dan sekuens DNA dalam satu primer tidak saling berkomplemen yang akan mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder
dan mengurangi efisiensi PCR. Deoxyribonucleaside triphosphate dNTP’s merupakan bahan dasar pembentuk DNA yang terdiri dari
dATP, dTTP, dGTP, dan dCTP. Taq DNA Polymerase berfungsi sebagai katalisator terjadinya pemanjangan primer. Buffer PCR yang biasanya
terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. Ion Mg
2+
yang biasanya terdapat dalam buffer berfungsi sebagai kofaktor enzim.
Keberadaan ion ini sangat penting karena ion Mg
2+
bebas akan mengikat DNA template, primer dan membentuk kompleks terlarut dengan dNTP
untuk membuat subtrat yang akan dikenali oleh enzim Taq Polymerase Zyskind dan Bernstain, 1992.
2.6 Real-Time PCR
