UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
60
o
C 97
o
C5
o
C 1 menit
- Cooling
1 Siklus 40
o
C 10 detik
Perc. 3 Jumlah Siklus
Suhu Waktu
Pre Incubation 1 Siklus
95
o
C 10 menit
Amplification 45 siklus
95
o
C 60
o
C 72
o
C 10 detik
20 detik 25 detik
Melting Curve Analysis
1 Siklus 95
o
C 60
o
C 97
o
C5
o
C 5 detik
1 menit -
Cooling 1 Siklus
40
o
C 10 detik
Keterangan: = Modifikasi yang dilakukan pada proses amplifikasi
Real Time PCR
3.3.4.2. Amplifikasi DNA dengan Metode Hydrolysis Probe
a. Pembuatan Primer dan Probe 10 μM dari Larutan Induk 100 μM
Sebanyak 10 μL larutan induk primer 100 μM dan probe 100 μM
masing-masing dimasukkan ke dalam Microsentrifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ke dalam tube tesebut masing-masing ditambahkan
90 μL aquadest. Larutan tersebut masing-masing dihomogenkan dengan menaik
turunkan pegas pada mikropipet. b. Pembuatan Hydrolysis Probe Mastermix Roche
d
, 2008
Mastermix dibuat dengan volume total 20 μL yang terdiri dari 5 μL
DNA yang diuji; 1,4 μL Aquabidest; 1,6 μL primer forward 10 μM; 1,6
μL primer reverse 10 μM; 0,4 μL probe 10 μM; dan 10 μL LightCycler® 480 Probe master enzim Taq DNA Polymerase, dNTP mix, dan 6,4 mM
MgCl
2
. c.
Loading Sampel dan Hydrolisis Probe Mastermix ke dalam Multiwell Plate Roche
d
, 2008 Sebanyak
5 μL DNA yang akan diuji dan 15 μL Mastermix dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan.
Campuran dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas mikropipet secara perlahan. Multiwell plate kemudian ditutup dengan sealing foil.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
d. Pengaturan Program Proses Amplifikasi Roche
d
, 2008 Proses pengaturan program LightCycler® 480 Real-Time PCR
yang akan digunakan untuk proses amplifikasi dilakukan sebagai berikut:
Tabel 5. Pengaturan program amplifikasi dengan metode Hydrolysis Probe
Analisis dengan Primer-probe Sapi Jumlah Siklus
Suhu Waktu
Pre Incubation 1 Siklus
95
o
C 10 menit
Amplification 60 siklus
95
o
C 60
o
C 10 detik
1 menit Cooling
1 Siklus 40
o
C 10 detik
Analisis dengan Primer-probe Babi Jumlah Siklus
Suhu Waktu
Pre Incubation 1 Siklus
95
o
C 10 menit
Amplification 60 siklus
95
o
C 60
o
C 10 detik
1 menit Cooling
1 Siklus 40
o
C 10 detik
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini dilakukan perbandingan metode SYBR Green dan metode Hydrolysis Probe dalam analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi
dengan menggunakan Real Time PCR. Perbandingan metode SYBR Green dan metode Hydrolysis Probe dilihat melalui hasil kurva amplifikasi apakah metode
tersebut dapat mengamplifikasi DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi secara spesifik.
4.1. Hasil Analisis Isolat DNA
Isolat DNA didapatkan dari proses ekstraksi dan isolasi DNA dengan menggunakan kit komersial High Pure PCR Template Preparation. Prinsip
kit ini yaitu DNA diabsorpsi oleh Silikon Dioksida SiO
2
sehingga DNA mudah dipisahkan dari protein dan sel debris hasil pelisisisan sel dengan cara
sentrifugasi Roche
b
, 2012. Reagen yang ditambahkan pada proses ekstraksi dan isolasi DNA meliputi: Tissue lysis buffer sebagai pelisis membran sel,
proteinase K sebagai enzim pemecah makromolekul protein menjadi molekul lebih kecil, Binding buffer sebagai chaotropic agent agar DNA dapat
terabsorbsi kuat dengan silikon dioksida yang terdapat pada filter, Inhibitor Removal Buffer sebagai buffer yang dapat menghilangkan zat pengotor yang
mengganggu proses PCR, Washing buffer sebagai pencuci garam chaotropic dan pengotor lainya, dan Elution Buffer sebagai pengelusi DNA dari silikon
dioksida Roche
b
, 2012. Isolat DNA yang didapatkan dianalisis dengan Elektroforesis Agarosa
dan Spektrofotometer UV.
4.1.1. Hasil Analisis Isolat DNA dengan Elektroforesis Agarosa
Isolat DNA divisualisasi keberadaannya dengan elektroforesis gel agarosa 1 seperti gambar sebagai berikut:
36
