UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
kondisi garam chaotropic seperti Guanidine-HCl. Garam ini dapat memecah ikatan hidrogen antara ion oksigen pada DNA dengan ion hidrogen pada air.
DNA yang terabsorpsi oleh silika dapat dipisahkan dari protein dan sel debris dengan pencucian. DNA murni kemudian dapat dielusi dari silika dengan
buffer Tris-EDTA atau Aquabidest Gjerse et al., 2009.
2.4 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis adalah suatu cara untuk memisahkan fraksi suatu campuran berdasarkkan pergerakan partikel koloid yang bermuatan dibawah
pengaruh medan listrik. Cara elektroforesis telah digunakan untuk analisa virus, asam nukleat, enzim, protein, serta molekul-molekul organik dengan
berat molekul rendah seperti asam amino Westermeier, 2004. Salah satu gel yang dapat digunakan pada elektroforesis adalah gel
agarosa. Agarosa digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen-fragmen DNA dengan ukuran molekul lebih besar dari
100 pb dan dijalankan secara horizontal. Molekul DNA termasuk senyawa bermuatan negatif. Sifat ini menjadikan molekul DNA yang ditempatkan
pada medan
listrik akan
bermigrasi menuju
kutub positif
Mobilitas fragmen DNA pada gel elektroforesis sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor Sambrook et al., 2001, yaitu:
1. Ukuran Molekul DNA
Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat
dibandingkan dengan fragmen DNA yang berukuran lebih besar. Sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen berdasarkan
ukuran panjangnya. 2.
Konsentrasi Agarosa Migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi lebih rendah lebih
cepat daripada migrasi molekul DNA yang sama pada gel berkonsentrasi tinggi.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 1. Kisaran umum konsentrasi agarosa Muladno, 2010
Konsentrasi Agarosa
Efisiensi Pemisahan DNA kb
0,3 5-60
0,6 1-20
0,7 0,8-10
0,9 0,5-7
1,2 0,4-6
1,5 0,2-3
2,0 0,1-2
3. Konformasi DNA
Konformasi atau bentuk rangkaian molekul DNA berukuran sama akan bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda. DNA dalam
bentuk sirkular akan lebih cepat bermigrasi dibandingkan dengan DNA bentuk linier.
4. Voltase yang Digunakan
Kecepatan migrasi DNA sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan. Akan tetapi, apabila penggunaan voltase terlalu tinggi,
mobilitas molekul DNA meningkat secara tajam. Hal ini mengakibatkan efektifitas pemisahan molekul DNA menurun
dengan meningkatnya voltase yang digunakan. Penggunaan voltase yang ideal untuk mendapatkan separasi molekul DNA berukuran
lebih besar 2 kb adalah tidak lebih dari 5 Volt per cm. 5.
Etidium Bromida Keberadaan etidium bromida di dalam gel dapat mengakibatkan
pengurangan tingkat kecepatan migrasi molekul DNA linear sebesar 15.
6. Komposisi Larutan Buffer
Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi DNA sangat lambat. Sementara
larutan buffer berkekuatan ion tinggi akan meningkatkan panas, sehingga aliran listrik menjadi sangat maksimal. Ada kemungkinan
gel akan meleleh dan DNA dapat mengalami denaturasi.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Visualisasi fragment DNA dilakukan dengan penambahan larutan etidium bromida yang akan masuk interkalasi di antara ikatan hidrogen pada
DNA, sehingga pita fragmen DNA akan terlihat di bawah lampu UV Pita DNA yang berpendar pada gel agarosa menunjukkan hasil positif bahwa
terdapat DNA pada setiap lajur. Larutan etidium bromida sangat berbahaya dan bersifat karsinogen, oleh karena itu semua larutan yang mengandung
etidium bromida harus didekontaminasi sebelum dibuang. Selain etidium bromida, pewarnaan dapat dilakukan dengan larutan SYBR safe sebagai
penggantinya Muladno, 2010; Sambrook dan Russel, 2001; Gaffar, 2007.
Gambar 2.10. Interkalasi Etidium Bromida pada DNA
Sumber: www.sciencemag.org
2.5 PCR 2.5.1 Pengertian PCR
