BAB 3 BAHAN DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei sd Oktober 2016 di Laboratorium Genetika dan Molekuler, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikropipet, autoclave, mesin PCR, nanofotometer, hot plate, thermo mixer, cooling dry, magnetik bar, beaker glass,
tabung erlenmeyer, mesin sentrifugasi, perangkat elektroforesis, waterbath, dan freezer.
Bahan yang digunakan adalah 11 koleksi padi lokal Sumatera Utara dan 1 koleksi padi Hibrida.
3.3 Prosedur 3.1 Persiapan Bahan Tanaman
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah 12 kultivar padi yang terdiri dari 11 aksesi padi lokal Sumatera Utara yaitu Sigudang, Sigambi, Siasahan,
Siorsik, Ramos, Kukubalam, Talipuyu, Sigambiri Merah, Sigambiri Putih, Martabe dan Mandailing, dan 1 aksesi padi hibrida yaitu IR64 11. Padi tersebut di ambil dari
koleksi BPTP Balai Pengkajian Teknologi Pertanian Medan, Sumatera Utara, dari BB Balai Benih Padi Sukamandi, Kec. Subang, Jawa Barat dan dari Petani
Kabupaten Labuhan Batu Utara dan Tapanuli Selatan. Semua bahan tanaman di semai hingga umur 2-3 minggu dan diisolasi.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 3.1 Daftar Sampel Padi yang digunakan dalam analisis keanekaragaman genetik
No Sampel Padi Jenis
Daerah Asal
1. IR64
Hibrida -
2. Sigudang
Gogo Kab. Tapanuli Selatan
3. SitolasSigambi
Gogo Kab. Labuhan Batu Utara
4. Siasahan
Gogo Kab. Tapanuli Selatan
5. Siorsik
Sawah Kab. Tapanuli Selatan
6. Ramos
Gogo Kab. Labuhan Batu Utara
7. Kukubalam
Gogo Kab. Labuhan Batu Utara
8. Talipuyu
Gogo Kab. Tapanuli Selatan
9. Sigambir Merah
Gogo dan sawah Kab. Karo dan Simalungun
10. Sigambir Putih Gogo dan sawah
Kab. Karo dan Simalungun 11. Martabe
Sawah Kab. Tapanuli Selatan
12. Mandailing Gogo
Kab. Mandailing Natal
3.2 Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan metode CTAB Cetyl Methyl Ammonium Bromide sesuai protokol yang direkomendasikan Doyle Doyle
1987 yang telah dimodifikasi. Daun padi sebanyak 0,1 g digunting kecil-kecil dan dimasukkan kedalam
mortar yang telah berisi 700 µL 2 CTAB buffer ekstraksi 20 mM EDTA, 0,1 M Tris-
HCL pH 8,0, 1,4 M NaCl, 2 CTAB, dan 0,4 β-mercaptolethanol yang telah di pre-heating pada suhu 65°C, kemudian digerus dengan menggunakan
pestle. Sampel yang telah halus dimasukkan ke dalam 1,5 mL mikrotube. Diinkubasi pada suhu 65°C selama 45 menit tiap 15 menit sampel divorteks lalu
ditambahkan 500 µ L fenol-klorofom-isoamilalkohol 25:24:1 dan divorteks. Sampel disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4 °C.
Supernatan dipindahkan ke tube baru dan ditambahkan 500 µ L fenol-klorofom- isoamilalkohol 25:24:1. Pada tahap ini diulang sebanyak 2 kali pengulangan.
Selanjutnya supernatan dipindahkan ke tube baru dan ditambahkan 700 µ L isopropanol dingin. Diinkubasi pada di dalam freezer selama 2 jam. Sampel
disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4 °C. Pelet dicuci
Universitas Sumatera Utara
dengan menggunakan alkohol 70 dan disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4 °C. Pelet dikeringkan sampai alkohol tidak berbau. Pelet di
larutkan dengan 100 µ L akuabides dan diinkubasi selama 1 jam dengan suhu 37°C dan disimpan pada suhu -20°C sebagai stok.
3.3 Uji Kualitatif dan Kuantitaif DNA Total
Kategori