27 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi DNA
Penelitian ini diawali dengan mengisolasi DNA E. coli. Metode yang umum digunakan dalam isolasi DNA yang banyak mengandung polisakarida
adalah dengan menggunakan metode CTAB Cetyltrimetyl Ammonium Bromide. Ada tiga langkah utama dalam isolasi DNA, yaitu perusakan dinding sel lisis,
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA Syafaruddin dan Tri Joko Santoso, 2011.
Langkah pertama yang dilakukan adalah perusakan dinding sel lisis. Perusakan dinding sel dilakukan dengan menggunakan TE buffer, SDS, dan
CTAB. Pemisahan bahan padat seperti selulosa dan protein dengan menggunakan proteinase-K, NaCl, kloroform : isoamilalkohol 24:1, dan PCI fenol : kloroform
: isoamilalkohol. Sedangkan pemurnian DNA dengan menggunakan isopropanol dan etanol K. Nishiguchi, Michele, dkk., 2002.
Sampel diisolasi sebanyak satu koloni, kemudian ditambahkan larutan TE buffer, SDS, dan proteinase-K kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama satu jam. Metode ini menggunakan TE buffer pH 8,0 yang terdiri dari 100 mM Tris-Cl
pH 8,0 dan 10 mM EDTA pH 8,0 Sambrook dan Russel, 2001. Tris-Cl merupakan dapar yang berfungsi untuk menjaga pH, sangat larut dalam air dan
inert untuk berbagai jenis reaksi enzimatik Sambrook dan Russel, 2001. Sedangkan EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid berfungsi sebagai bahan
pengkhelat yang
mengikat kation
divalen, sehingga
mengakibatkan ketidakstabilan membran Dale dan Malcom, 2002. Penggunaan SDS Sodium
Dedosil SulfateNatrium Lauril Sulfat sebagai detergen anonik untuk melisiskan dinding sel dengan cara melarutkan membran lipid, sehingga dinding sel menjadi
rusak dan mengeluarkan komponen-komponennya, yaitu protein, lipid, polisakarida, DNA, dan RNA Dale dan Malcom, 2002; Surzycki, 2003.
Proteinase-K digunakan pada tahap pemecahan protein. Proteinase-K disini yang merupakan salah satu dari enzim golongan serin protease yang
merupakan protease endolitik, memecah ikatan peptida sisi karboksilat pada
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
gugus alifatik dan aromatik khususnya alanin, sehingga digunakan untuk menghilangkan kontaminan dari protein. Sweeney dan Walker, 1993; Surzycki,
2003; Agrawal, 2008. Kemudian ditambahkan NaCl 5 M yang berfungsi sebagai pengendap protein dan CTAB dalam larutan dengan ion yang tinggi konsentrasi
NaCl 0,7 M digunakan sebagai pengendap protein dimana CTAB akan membentuk kompleks dengan protein dan polisakarida tetapi tidak akan
mengendapkan DNA Sambrook dan Russel, 2001. NaCl dengan kandungan garam yang tinggi dapat memisahkan polisakarida dari dinding sel Syafaruddin
dan Tri Joko Santoso, 2011 yang dikenal dengan fenomena salting out, yaitu fenomena penurunan kelarutan protein pada konsentrasi garam yang tinggi
Holme, David. J dan Hazel Peck, 1998. Residu dari protein dan lipid dapat dihilangkan dengan penambahan
kloroform dan isoamilalkohol dengan perbandingan 24:1 K. Nishiguchi, Michele, dkk., 2002. Kloroform dan isoamilalkohol memiliki fungsi sebagai pendenaturasi
protein, dimana DNA dan RNA sendiri tidak akan ikut terdenaturasi karena DNA dan RNA ini tidak larut dalam pelarut organik seperti kloroform Syafaruddin dan
Tri Joko Santoso, 2011. Kemampuan deproteinisasi dari kloroform didasarkan pada kemampuan dari kloroform untuk mendenaturasi rantai polipeptida yang
sebagian masuk atau termobilisasi pada interfase air-kloroform sedangkan isoamilalkohol digunakan untuk mempermudah dalam meningkatkan luas
tegangan permukaan dari air-kloroform, sehingga memudahkan dalam pemisahan air dan kloroform Agrawal, 2008. Pengendapan protein dengan polisakarida dan
komponen lain yang telah lisis selain dengan bantuan garam juga dipisahkan dengan cara pengendapan dengan bantuan sentrifugasi.
Penambahan PCI Fenol-Kloroform-Isoamilalkohol juga membantu dalam menghilangkan protein dari DNA Sambrook dan Russel, 2001.
Penambahan kloroform-isoamilalkohol dengan PCI dilakukan dua kali untuk memaksimalkan pemisahan DNA dengan komponen-komponen lain yang dapat
mengkontaminasi DNA. DNA total kemudian dipisahkan dari larutan dengan cara pengendapan
dengan menggunakan isopropanol Sambrook dan Russel, 2001 dan etanol 70 Agrawal, 2008; Surzycki, 2003. Etanol 70 selain berfungsi sebagai pengendap
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DNA juga sebagai penghilang fenol-kloroform dan juga garam yang masih terdapat dalam DNA Sambrook dan Russel, 2001; Syafaruddin dan Tri Joko
Santoso, 2011. Konsentrasi dari genom diukur dengan menggunakan Nano Drop ND-
1000 pada panjang gelombang 260 nm. Konsentrasi yang diperoleh dari pengukuran genom Leptospira dengan menggunakan Nano Drop 225,5 ng
l dan kemurnian 1,825. Sedangkan genom E. coli memberikan konsentrasi 546,8 ng
l dengan kemurnian 2,065. Dari hasil pengukuran tersebut menunjukkan kualitas
dan kuantitas DNA baik. Nilai kemurnian genom diperoleh antara perbandingan panjang gelombang
260 nm dan 280 nm Harisha. S., 2007 dan dikatakan murni jika berada dalam kisaran antara 1,8-2,0 Sambrook, dkk, 1989. Sementara itu nilai kemurnian yang
ditunjukkan dari isolasi genom E. coli memberikan hasil lebih dari 2,0 yang menunjukkan adanya kontaminasi dari RNA Stephenson, 2003. Kontaminasi
dari RNA disebabkan tidak digunakannya RNase yang berfungsi untuk memecah RNA yang dapat mengurangi adanya kontaminasi dari RNA Surzycki, 2003 dan
adanya kontaminasi dari RNA dapat dibuktikan dengan adanya pola bayangan smear di bawah pita DNA pada visualisai gel agarosa Sauer, dkk., 1998.
Genom kemudian divisualisasikan dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1 dengan menggunakan tegangan 100 volt. Gel ditambahkan SYBR
safe yang digunakan untuk memvisualisasikan DNA di agarosa dan
diformulasikan khusus untuk menjadi alternatif yang lebih aman dibanding etidium bromida Anonim, 2013.
DNA yang akan dielektroforesis ditambahkan loading dye yang terdiri dari glycerol dan bromphenol blue. Glycerol berfungsi sebagai pemberat yang
menyebabkan DNA berada di bawah sumur gel, sedangkan bromphenol blue berfungsi sebagai visualisasi pada gel Carson, 2006 sehingga proses
elektroforesis dapat terlihat dan tidak melebihi jarak yang diinginkan. Hasil elektroforesis tersebut ditampilkan pada Gambar 7.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Keterangan : 1. Leptospira
2. E. coli M. Ladder 100 bp
Gambar 7. Hasil elektroforesis isolasi genom dari Leptospira dan E. coli
Hasil pengamatan pada gel documentation Gambar 7 menunjukkan hasil isolasi dari genom E. coli dan Leptospira. Gambar ini menunjukkan pola
bayangan smear di bawah pita DNA yang menunjukkan DNA tidak utuh sehingga menyebabkan timbulnya fragmen-fragmen yang berbeda ukuran dan tertahan pada
gel sesuai dengan ukurannya. Pola bayangan smear juga dapat menunjukkan adanya kontaminasi dari RNA sedangkan hasil isolasi yang baik ditandai dengan
pita yang dihasilkan jelas dan tidak adanya pola bayangan smear di bawah pita DNASauer dkk., 1998.
4.2 Polymerase Chain Reaction PCR
Kategori