Amplifikasi Insulated Isothermal PCR ii-PCR

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta mengamplifikasi DNA dari Leptospira dan tidak dapat mengamplifikasi DNA E.coli.

3.4.8 Uji Sensitivitas Primer

Sensitivitas PCR dilakukan dengan melakukan pengenceran DNA Leptospira dengan konsentrasi yang digunakan 200 ng25 l, 20 ng25 l, 2 ng25 l, 0,2 ng25 l, 0,02 ng25 l, 0,002 ng25 l, dan 0,0002 ng25 l. Masing- masing konsentrasi diamplifikasi dengan kondisi PCR yang sama dan dilihat sampai konsentrasi berapa primer yang digunakan dapat mengamplifikasi DNA Leptospira yang digunakan.

3.5 Insulated Isotermal PCR ii-PCR

3.5.1 Amplifikasi Insulated Isothermal PCR ii-PCR

Amplifikasi PCR dilakukan dengan campuran reaksi total PCR Lampiran 5 dan dibuat dalam volume 50 µL. Setelah campuran reaksi total PCR dibuat, campuran reaksi tersebut dimasukkan ke dalam R-tube dan diletakkan pada multiwell plate yang kemudian diletakkan pada mesin insulated isothermal PCR. Kemudian program amplifikasi dijalankan dan hasil amplifikasi DNA dapat dilihat pada akhir reaksi dalam bentuk “+” atau “-“. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.6 Alur Penelitian DNA Leptospira yang sudah terisolasi Amplifikasi DNA dengan PCR konvensional Penentuan Konsentrasi DNA Isolasi Bakteri Pembanding Ekstraksi DNA bakteri Pembanding DNA terisolasi DNA tidak terisolasi Cek dengan elektroforesis Primer Spesifik Primer tidak spesifik Amplifikasi DNA dengani ii-PCR Hasil Cek dengan Elektroforesis 27 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi DNA

Penelitian ini diawali dengan mengisolasi DNA E. coli. Metode yang umum digunakan dalam isolasi DNA yang banyak mengandung polisakarida adalah dengan menggunakan metode CTAB Cetyltrimetyl Ammonium Bromide. Ada tiga langkah utama dalam isolasi DNA, yaitu perusakan dinding sel lisis, pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA Syafaruddin dan Tri Joko Santoso, 2011. Langkah pertama yang dilakukan adalah perusakan dinding sel lisis. Perusakan dinding sel dilakukan dengan menggunakan TE buffer, SDS, dan CTAB. Pemisahan bahan padat seperti selulosa dan protein dengan menggunakan proteinase-K, NaCl, kloroform : isoamilalkohol 24:1, dan PCI fenol : kloroform : isoamilalkohol. Sedangkan pemurnian DNA dengan menggunakan isopropanol dan etanol K. Nishiguchi, Michele, dkk., 2002. Sampel diisolasi sebanyak satu koloni, kemudian ditambahkan larutan TE buffer, SDS, dan proteinase-K kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama satu jam. Metode ini menggunakan TE buffer pH 8,0 yang terdiri dari 100 mM Tris-Cl pH 8,0 dan 10 mM EDTA pH 8,0 Sambrook dan Russel, 2001. Tris-Cl merupakan dapar yang berfungsi untuk menjaga pH, sangat larut dalam air dan inert untuk berbagai jenis reaksi enzimatik Sambrook dan Russel, 2001. Sedangkan EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid berfungsi sebagai bahan pengkhelat yang mengikat kation divalen, sehingga mengakibatkan ketidakstabilan membran Dale dan Malcom, 2002. Penggunaan SDS Sodium Dedosil SulfateNatrium Lauril Sulfat sebagai detergen anonik untuk melisiskan dinding sel dengan cara melarutkan membran lipid, sehingga dinding sel menjadi rusak dan mengeluarkan komponen-komponennya, yaitu protein, lipid, polisakarida, DNA, dan RNA Dale dan Malcom, 2002; Surzycki, 2003. Proteinase-K digunakan pada tahap pemecahan protein. Proteinase-K disini yang merupakan salah satu dari enzim golongan serin protease yang merupakan protease endolitik, memecah ikatan peptida sisi karboksilat pada