UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4. Voltase yang digunakan
Perpindahan molekul DNA di dalam gel dirangsang oleh arus listrik yang mengalir dari kutub negatif menuju kutub positif. Pada voltase
rendah, DNA linear mengalami perpindahan secara proposional. Semakin besar tegangan arus listrik, maka perpindahan molekul
DNA semakin cepat, demikian pula sebaliknya. Untuk mencapai resolusi maksimum dari fragmen DNA dengan ukuran 2 kb, gel
agarosa harus dijalankan tidak boleh lebih dari 5-8 Vcm. 5.
Tipe agarosa Terdapat dua tipe utama dari agarosa yaitu agarosa standar dan
agarosa pada suhu rendah low-melting temperature. 6.
Buffer elektroforesis Mobilitas elektroforesis DNA dipengaruhi oleh komposisi dan
kekuatan ionik buffer elektroforesis.
2.5 Insulated Isothermal PCR ii-PCR
Didasarkan pada reaksi teknologi beratai polimerase PCR, yang merupakan teknik biologi molekuler yang digunakan untuk amplifikasi asam
nukleat. Dengan sensitivitas tinggi dan spesifitas, PCR telah menjadi alat yang ampuh dan sering sangat diperlukan dalam aplikasi medis dan biologis termasuk
pengujian genetik, deteksi, diagnosis penyakit menular, dan sidik jari genetik untuk ilmu forensik dan pengujian paternitas Anonim, 2012.
Insulated Isotermal PCR ii-PCR didasarkan pada teknologi isotermal terisolasi yang memanfaatkan fenomena konveksi termal alami untuk mendorong
reaksi PCR. Reaksi ii-PCR dilakukan dalam tabung kapiler yang dirancang khusus, R-tube yang merupakan perangkat PCR konvektif menyediakan isolasi
dengan sumber panas tunggal isotermal. Ketika pemanasan isotermal 95
o
C diterapkan ke bagian bawah R-tube, solusi panas menjadi pematik api
menghasilkan arus untuk naik dan solusi pendingin di bagian atas menjadi lebih berat untuk turun. Akibatnya, arus konveksi dengan gradien termal sepanjang R-
tube dihasilkan untuk reaksi PCR. Reaksi konvektif terus-menerus membuat
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
reaksi PCR sangat efisien dan dapat mengurangi waktu reaksi PCR rutin secara signifikan tanpa mempengaruhi sensitivitas Anonim, 2012.
Gambar 6. Reaksi ii-PCR
Beberapa komponen insulated isothermal PCR yang perlu diperhatikan yaitu Anonim, 2012 :
1. Buffer
Insulated isothermal PCR menggunakan Uni-ii buffer yang mengandung reagen-reagen yang berfungsi untuk mengoptimasi laju
konveksi termal, menstabilisasi gradien temperatur, mengurangi
Keterangan gambar : 1.
Reaksi terisolasi oleh perisai termal 2.
Konveksi termal alami diinduksi oleh panas 3.
Konveksi termal peredaran cairan dan hasil dalam reaksi PCR 4.
Denaturasi dari dsDNA 5.
Penempelan Primer 6.
Perpanjangan dari strand baru 7.
DNA diduplikasi dengan penyelesaian dari 1 perputaran dari konveksi termal
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
interaksi antara larutan dan R-tube, dan meningkatkan efisiensi DNA polimerase untuk keberhasilan reaksi ii-PCR.
2. R-tube
Tube terbuat dari bahan plastik optik yang memastikan transmisi fluoresensi yang optimal. Bahan plastik berkelas medis juga
memastikan bahwa produk bebas dari DNase dan RNase. Tube telah dipatenkan dengan rasio diameter dan panjang tertentu yang
memastikan konveksi isotermal untuk reaksi ii-PCR yang optimal. Tutup yang didesain secara khusus menjaga keamanan reaksi larutan
dan mencegah penguapan pada saat reaksi berlangsung yang dapat menyebabkan kontaminasi.
3. Probe
Probe POCKIT harus: a.
Terdiri dari 40-80 GC b.
Mempunyai panjang 15-30 basa, lebih pendek lebih baik. c.
Menghindari daerah target pada template yang dapat membentuk struktur sekunder.
d. Membuat proses annealing antara probe 5’- dan template cukup
kuat dan bebas energi.
21 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Gen, Balai Pengkajian Bioteknologi-BPPT Serpong, Tangerang. Waktu pelaksanaan dari
bulan Maret 2013 sampai November 2013.
3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat
Alat yang digunakan adalah pipet mikro 0,1-2 l, 2-20 l, 20-200 l, 100-
1000 l [Finnpipette, BIO-RAD, Nichiryo, BenchMate], tip 10 l, 100 l, dan
1000 l [Sorenson], freezer -20
o
C [Angelantoni Scientifica], lemari pendingin 4
o
C [Glacio-TOSHIBA], mesin PCR [TaKaRa BIO-RAD], thermostat shaking
bath [Heto], tabung sentrifugasi 15 ml [Iwaki, Corning, FALCON, BIOLOGIX], tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml [Sorenson], tabung mikrosentrifugasi 200
l [Axygen], rak tabung, mesin sentrifugasi [Beckman J2-HS Tomy, timbangan
[Metter], ice maker [HOSHIZAKI], vorteks [Heidolph], magnetic stirrer [Heidolph MR30001], inkubator [memmert], microwave [National], laminar air
flow, heat block [Thermolyne], spatula, gunting , elektroforesis tray [Bio-rad], chamber elektroforesis [Mupid2], comb, gel documentation, spektrofotometer
Nano Drop ND-1000. Alat gelas yang digunakan adalah gelas ukur, labu Erlenmeyer 100 ml 250 ml, gelas Beker 600 ml 1000 ml, tabung
penyimpanan bahan 50 ml, 100 ml, 250 ml 500 ml[Schott-DURAN], R-tube, petri dish, ose, bunsen.
