UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah DNA Leptospira interrogens yang sudah terisolasi yang diperoleh dari Balai Besar Penelitian
Vektor dan Reservoir Penyakit Salatiga, dan bakteri Eschericia coli DH5-Alpha. Bahan lain yang digunakan CTAB Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide 10, TE
Tris-EDTA buffer 1X, SDS Sodium Dodecyl Sulfate 10, proteinase-K 18 mgml, NaCl Natrium Klorida 5M, buffer TAE Tris Acetate EDTA 0,5X,
kloroform, isoamilalkohol, isopropanol, etanol 70, Fenol, Tripton, Yeast Extract, Bacto Agar, Go Taq
Green Master Mix, primer spesifik Leptospira, agarosa, TAE 0,5 x, SYBR
safe, probe, buffer ii-PCR.
3.3 Tahapan Penelitian
1. Persiapan sampel pembanding dan DNA Leptospira
2. Isolasi DNA pembanding
3. Cek DNA bakteri pembanding dengan elektroforesis
4. Amplifikasi DNA Leptospira dengan PCR konvensional
5. Pembuatan gel agarosa dan elektroforesis
6. Dokumentasi gel
7. Optimasi ii-PCR
3.4 Prosedur Kerja
3.4.1 Persiapan Media Tumbuh E. coli
Media Luria Bertani LB padat, sebanyak 1 gram tripton, 0,5 gram yeast extract, 0,5 gram NaCl, dan 1,5 gram bacto agar di masukkan ke dalam
erlenmeyer, ditambahkan aqua dest 100 ml dan ditutup dengan sumbat kapas. Campuran larutan diaduk hingga homogen dan disterilkan dalam autoklaf pada
suhu 121
o
C selama 15 menit. Larutan homogen yang sudah disterilkan di tuang masing-masing sebanyak 25 ml ke dalam 4 petri dish dan biarkan hingga
mengeras. Setelah itu media disimpan di lemari pendingin pada suhu 4
o
C.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.4.2 Peremajaan
E. coli
Biakan stok E. coli dalam media LB padat dipindahkan sebanyak satu ose, digoreskan secara zig zag ke dalam petri dish yang berisi media LB padat dan
diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 16-18 jam.
3.4.3 Isolasi DNA E. coli
Satu koloni dipilih dengan menggunakan tusuk gigi steril dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi steril di tambahkan TE buffer sebanyak 557
l. Campuran diresuspensi atau divortex. Tambahkan 30
l SDS 10 dan 3 l proteinase-K. Campur dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C. Setelah diinkubasi tambahkan 100
l NaCl 5M dan dicampur. Ditambahkan 80 l CTAB 10, inkubasi pada suhu 65
o
C selama 10 menit. Kemudian tambahkan kloroform dan isoamilalkohol volume sama banyak. Sentrifus pada kecepatan 13.000 rpm
selama 5 menit pada suhu 4
o
C, dan pindahkan larutan ke tube baru. Tambahkan PCI volume sama banyak dan aduk rata. Sentrifus pada kecepatan 14.000 rpm
selama 5 menit pada suhu 4
o
C dan pindahkan supernatan ke tube baru. Ulangi ekstraksi kembali kloroform : isoamilalkohol saja. Tambahkan 0,6 ml
isopropanol dan campur sampai DNA mengendap. Sentrifus pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4
o
C dan buang isopropanol. Tambahkan 1 ml etanol 70 untuk mencuci garam dari DNA. Sentrifus pada kecepatan 13.000
rpm selama 5 menit pada suhu 4
o
C dan buang etanol, keringkan pada suhu ruangan. Resuspensi pelet dengan 50-100
l TE buffer dan simpan pada suhu 4
o
C.
3.4.4 Pembuatan Gel Agarosa dan Elektroforesis 3.4.4.1 Pembuatan Gel Agarosa 1
