UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
spesifitasnya. Konsentrasi ion ini tergantung pada konsentrasi bahan-bahan yang mengikatnya seperti dNTP, EDTA, dan fosfat Sulistyaningsih,
2007.
2.3.2 Tahapan PCR
1. Denaturasi Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka
menjadi dua untai tunggal Gaffar, 2007. Suhu denaturasi dipengaruhi oleh sekuen target. Jika sekuen target
kaya akan G-C maka diperlukan suhu yang lebih tinggi. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi dan waktu denaturasi yang terlalu lama
mengakibatkan hilangnya atau berkurangnya aktivitas enzim Taq polimerase. Waktu paruh aktivitas enzim Taq polimerase adalah 2 jam
pada suhu 92,5
o
C, 40 menit pada 95
o
C dan 5 menit pada 97,5
o
C Sulistyaningsih, 2007.
2. Penempelan Primer Annealing Annealing primer dimaksudkan untuk proses penempelan primer
sekuen target DNA. Suhu dan lamanya waktu yang dibutuhkan untuk
annealing primer juga tergantung pada komposisi basa, panjang, dan konsentrasi primer. Suhu annealing biasanya 5
o
C dibawah nilai Tm primer, berada pada range 55-72
o
C Sulistyaningsih, 2007. 3. Extension
Suhu extension ditujukan untuk proses perpanjangan sekuen DNA. Suhu extension
biasanya dipilih 72
o
C karena merupakan suhu optimum enzim Taq polimerase. Suhu extension yang rendah bersamaan dengan
konsentrasi dNTP yang tinggi mengakibatkan misextension primer dan perpanjangan nukleotida yang salah, sebaliknya kombinasi antara suhu
annealingextension yang tinggi dengan dNTP yang rendah akan menghasilkan ketepatan produk akhir PCR yang tinggi. Lamanya waktu
extension tergantung pada panjang sekuen target, konsentrasi sekuen target, dan suhu extension Sulistyaningsih, 2007.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Jumlah siklus yang optimum terutama tergantung pada konsentrasi awal DNA template saat parameter lain telah dioptimasi, biasanya 25-35
siklus. Siklus yang terlalu sedikit akan memberikan hasil yang sedikit, sebaliknya bila terlalu banyak akan meningkatkan jumlah dan
kompleksitas produk non spesifik Sulistyaningsih, 2007.
Gambar 5. Siklus PCR yang terdiri dari denaturasi, penempelang primer, dan polimerisasinya Gaffar, 2007.
2.4 Elektroforesis Gel Agarosa
