Polymerase Chain Reaction PCR

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Keterangan : 1. Leptospira 2. E. coli M. Ladder 100 bp Gambar 7. Hasil elektroforesis isolasi genom dari Leptospira dan E. coli Hasil pengamatan pada gel documentation Gambar 7 menunjukkan hasil isolasi dari genom E. coli dan Leptospira. Gambar ini menunjukkan pola bayangan smear di bawah pita DNA yang menunjukkan DNA tidak utuh sehingga menyebabkan timbulnya fragmen-fragmen yang berbeda ukuran dan tertahan pada gel sesuai dengan ukurannya. Pola bayangan smear juga dapat menunjukkan adanya kontaminasi dari RNA sedangkan hasil isolasi yang baik ditandai dengan pita yang dihasilkan jelas dan tidak adanya pola bayangan smear di bawah pita DNASauer dkk., 1998.

4.2 Polymerase Chain Reaction PCR

Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan konsentrasi DNA template 200 ng 25 l. Konsentrasi ini optimal untuk mendapatkan amplikon yang tebal pada 25 siklus. Suhu optimal annealing yang digunakan untuk primer Leptospira adalah 50 o C untuk dan waktu reaksi PCR untuk mengamplifikasi DNA Leptospira dengan primer spesifik Leptospira adalah 150 menit. Uji spesifitas dari primer Leptospira dilakukan untuk menguji kemampuan dari primer Leptospira yang digunakan hanya mampu mengamplifikasi DNA Leptospira dan tidak dapat mengamplifikasi DNA yang lain, yang dalam penelitian ini yang digunakan sebagai pembanding adalah E. coli. Gambar 8 merupakan hasil uji spesifitas dari primer Leptospira yang digunakan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Keterangan : 1. E. coli 2. Leptospira M. Ladder 100 bp 139 bp Gambar 8. Hasil elektroforesis produk PCR menggunakan primer Leptospira pada uji spesifitas primer Pada gambar 8 dapat terlihat bahwa primer Leptospira yang digunakan hanya dapat mengamplifikasi DNA Leptospira, sedangkan DNA E. coli tidak teramplifikasi sama sekali, sehingga dapat dikatakan bahwa primer Leptospira yang digunakan spesifik. Proses amplifikasi DNA Leptospira menghasilkan panjang produk 139 pasang basa yang terletak pada lokus 16S Ribosomal RNA. Pasang basa yang dihasilkan diusahakan dalam kisaran pendek untuk mempermudah dalam pengujian dengan menggunakan ii-PCR Anonim, 2012. Uji sensitivitas dari primer Leptospira ini dimaksudkan untuk mengukur kemampuan dari primer Leptospira yang digunakan dalam mengamplifikasi konsentrasi terendah dari DNA Leptospira yang digunakan dalam sampel. Sensitivitas primer Leptospira dilakukan dengan melakukan pengenceran DNA Leptospira dengan seri konsentrasi yang digunakan adalah 200 ng25 l, 20ng25 l, 2ng25l, 0,2 ng25l, 0,02 ng25l, 0,002 ng25l, dan 0,0002 ng25 l. Gambar 9 menunjukkan hasil elektroforesis dari uji sensitivitas dari primer yang digunakan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Keterangan : 1. Konsentrasi DNA 200 ng25 µ L 2. KonsentrasiDNA 20 ng25 µ L 3. KonsentrasiDNA 2 ng25 µL 4. KonsentrasiDNA 0,2 ng25 µ L 5. KonsentrasiDNA 0,02ng25 µ L 6.KonsentrasiDNA 0,002ng25 µ L 7.KonsentrasiDNA 0,0002ng25 µ L Gambar 9. Hasil elektroforesis produk PCR dengan menggunakan primer spesifik DNA Leptospira pada uji sensitivitas primer. Pada gambar 9 dapat terlihat, dari tujuh konsentrasi yang digunakan, primer Leptospira mampu mengamplifikasi DNA Leptospira sampai dengan konsentrasi 0,002 ng25 µL, meskipun pada konsentrasi 0,002 ng25 µL menghasilkan pita yang tipis. Pada konsentrasi 0,0002 ng25 µL tidak terlihat adanya pita pada gel elektroforesis yang menandakan bahwa primer Leptospira tidak dapat mengamplifikasi DNA Leptospira pada konsentrasi 0,0002 ng25 µL, sehingga dapat dikatakan bahwa primer spesfik Leptospira yang digunakan sensitif dan mampu mengamplifikasi DNA Leptospira sampai konsentrasi 0,002 ng25 µ L.

4.3 Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction ii-PCR