UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.4.2 Peremajaan
E. coli
Biakan stok E. coli dalam media LB padat dipindahkan sebanyak satu ose, digoreskan secara zig zag ke dalam petri dish yang berisi media LB padat dan
diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 16-18 jam.
3.4.3 Isolasi DNA E. coli
Satu koloni dipilih dengan menggunakan tusuk gigi steril dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi steril di tambahkan TE buffer sebanyak 557
l. Campuran diresuspensi atau divortex. Tambahkan 30
l SDS 10 dan 3 l proteinase-K. Campur dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C. Setelah diinkubasi tambahkan 100
l NaCl 5M dan dicampur. Ditambahkan 80 l CTAB 10, inkubasi pada suhu 65
o
C selama 10 menit. Kemudian tambahkan kloroform dan isoamilalkohol volume sama banyak. Sentrifus pada kecepatan 13.000 rpm
selama 5 menit pada suhu 4
o
C, dan pindahkan larutan ke tube baru. Tambahkan PCI volume sama banyak dan aduk rata. Sentrifus pada kecepatan 14.000 rpm
selama 5 menit pada suhu 4
o
C dan pindahkan supernatan ke tube baru. Ulangi ekstraksi kembali kloroform : isoamilalkohol saja. Tambahkan 0,6 ml
isopropanol dan campur sampai DNA mengendap. Sentrifus pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4
o
C dan buang isopropanol. Tambahkan 1 ml etanol 70 untuk mencuci garam dari DNA. Sentrifus pada kecepatan 13.000
rpm selama 5 menit pada suhu 4
o
C dan buang etanol, keringkan pada suhu ruangan. Resuspensi pelet dengan 50-100
l TE buffer dan simpan pada suhu 4
o
C.
3.4.4 Pembuatan Gel Agarosa dan Elektroforesis 3.4.4.1 Pembuatan Gel Agarosa 1
Gel agarosa 1 dibuat dengan menambahkan 0,25 gr agarosa dalam 25 ml buffer TAE 0,5x, dipanaskan hingga larut 1 menit dalam microwave. Larutan
agarosa didinginkan hingga suhu 40
o
C dan ditambah dengan SYBR safe 0,5 l,
dituang ke dalam tray. Agarosa didinginkan hingga membeku selama 30-45 menit
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.4.4.2 Elektroforesis
Gel diangkat dari cetakan dan dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis kemudian ditambahkan buffer TAE 0,5x sehingga gel terendam
kira-kira 1 mm. Sebanyak 5 l sampel DNA dicampur dengan 21 l loading dye
kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel dan ladder dimasukkan 3 l sebagai
marker. Alat elektroforesis dinyalakan diberi arus listrik selama 30 menit. DNA akan bergerak menuju muatan positif. Hasil elektroforesis dilihat dengan
menggunakan dokumentasi gel gel documentation.
3.4.5 Gel Documentation
Komputer dan kamera digital dinyalakan. Gel agarosa hasil dari elektroforesis dimasukkan ke dalam UV transiluminator. UV transiluminator
dinyalakan dan pita DNA akan berpendar saat terkena sinar UV. Hasil gel agarosa saat disinari UV didokumentasikan dalam komputer.
3.4.6 Amplifikasi PCR Amplifikasi menggunakan dua jenis primer spesifik untuk Leptospira.
Amplifikasi DNA dilakukan dalam total volume 25 l Lampiran 4.
Denaturasi awal DNA pada 93
o
C selama 3 menit, denaturasi pada 93
o
C selama 3 menit, annealing pada 50
o
C selama 1 menit, dan ekstensi 72
o
C selama 1 menit. Akhir ekstensi diamplifikasi pada suhu 72
o
C selama 5 menit dan dilakukan dalam 25 siklus.
Produk dianalisa di gel agarosa 1 dilihat di bawah pencahayaan UV dan didokumentasikan
3.4.7 Uji Spesifitas Primer
Primer yang digunakan diuji spesifitasnya dengan menggunakan PCR konvensional. Primer spesifik DNA Leptospira digunakan untuk mengamplifikasi
DNA dari E. coli dan DNA Leptospira. Hasil PCR kemudian dielektroforesis dan dibandingkan. Primer spesifik DNA Leptospira dikatakan spesifik jika hanya
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
mengamplifikasi DNA dari Leptospira dan tidak dapat mengamplifikasi DNA E.coli.
3.4.8 Uji Sensitivitas Primer
