Ekstraksi Senyawa Aktif Antioksidan dari Lintah Laut (Discodoris sp.) asal Perairan Kepulauan Belitung.
EKSTRAKSI SENYAWA AKTIF ANTIOKSIDAN DARI
LINTAH LAUT (
Discodoris
sp.) ASAL PERAIRAN
KEPULAUAN BELITUNG
Oleh :
Rizki Andriyanti C34050241
DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2009
(2)
RINGKASAN
RIZKI ANDRIYANTI. C34050241. Ekstraksi Senyawa Aktif Antioksidan dari Lintah Laut (Discodoris sp.) asal Perairan Kepulauan Belitung. Dibimbing oleh NURJANAH dan ASADATUN ABDULLAH.
Radikal bebas terbentuk secara terus-menerus dalam tubuh manusia, baik melalui pengaruh eksogen maupun endogen. Radikal bebas adalah senyawa kimia yang memiliki satu atau lebih elektron tidak berpasangan di kulit terluar sehingga sangat reaktif dan mampu bereaksi dengan protein, lipid, atau DNA. Reaktivitas radikal bebas ini dapat diredam oleh senyawa antioksidan. Antioksidan sintetik yang berkembang saat ini dikhawatirkan memberi efek samping yang berbahaya bagi kesehatan manusia. Potensi antioksidan alami harus dikembangkan untuk memperoleh antioksidan yang lebih aman dikonsumsi. Salah satu sumber daya perairan yang berpotensi sebagai penghasil antioksidan alami adalah lintah laut (Discodoris sp.).
Tujuan dari penelitian ini adalah mempelajari karakteristik lintah laut dari Perairan Kepulauan Belitung, mempelajari pengaruh perbedaan jenis pelarut terhadap persentase rendemen dan aktivitas antioksidan ekstrak kasar lintah laut, serta menentukan komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar lintah laut. Pada penelitian ini dilakukan (1) pengambilan dan preparasi bahan baku, (2) karakterisasi bahan baku, (3) ekstraksi komponen antioksidan, dan (4) uji ekstrak kasar.
Karakteristik lintah laut (Discodoris sp.) yang berasal dari Perairan Kepulauan Belitung meliputi rendemen daging dan jeroan segar sebesar 41,79 % dan 58,21 %, sedangkan rendemen daging dan jeroan lintah laut kering sebesar 7,20 % dan 8,64 %. Daging lintah laut kering memiliki kadar air (10,45 %), kadar abu (11,97 %), kadar abu tidak larut asam (0,20 %), kadar lemak (1,41 %), kadar protein (59,11 %), dan kadar karbohidrat (17,08 %).Hal ini menunjukkan lintah laut memiliki kandungan gizi yang cukup tinggi.
Ekstraksi lintah laut menggunakan tiga pelarut polar (etanol, metanol, dan aquabides) menghasilkan persentase rendemen dan aktivitas antioksidan yang tidak berbeda nyata (P>0,05). Aquabides memiliki keunggulan dari segi keamanannya. Aquabides tidak bersifat toksik dan terbebas dari kontaminan serta garam-garam anorganik sehingga dapat memperkecil peluang ekstrak kasar terkontaminasi bahan lain.
Uji fitokimia menunjukkan bahwa komponen bioaktif yang terkandung dalam ekstrak lintah laut dari ketiga pelarut polar (etanol, metanol, dan aquabides) meliputi golongan alkaloid, flavonoid, karbohidrat, dan gula pereduksi. Komponen bioaktif golongan fenol hidrokuinon dan peptida hanya terdapat pada ekstrak aquabides lintah laut.
(3)
EKSTRAKSI SENYAWA AKTIF ANTIOKSIDAN DARI
LINTAH LAUT (
Discodoris
sp.) ASAL PERAIRAN
KEPULAUAN BELITUNG
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Institut Pertanian Bogor
Oleh : Rizki Andriyanti
C34050241
DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2009
(4)
Judul Skripsi : EKSTRAKSI SENYAWA AKTIF ANTIOKSIDAN DARI LINTAH LAUT (Discodoris sp.) ASAL PERAIRAN KEPULAUAN BELITUNG
Nama : Rizki Andriyanti
NRP : C34050241
Menyetujui,
Pembimbing I Pembimbing II
Ir. Nurjanah, MS Asadatun Abdullah S.Pi, M.Si NIP : 195910131986012002 NIP : 198304052005012001
Mengetahui,
Ketua Departemen Teknologi Hasil Perairan
Dr. Ir. Linawati Hardjito, MS NIP : 196205281987032003
(5)
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul Ekstraksi Senyawa Aktif Antioksidan dari Lintah Laut (Discodoris sp.) asal Perairan Kepulauan Belitung adalah karya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada Perguruan Tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang telah diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, September 2009
Rizki Andriyanti C34050241
(6)
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan Rahmat dan Karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik.
Skripsi hasil penelitian dengan judul ”Ekstraksi Senyawa Aktif Antoksidan dari Lintah Laut (Discodoris sp.) asal Perairan Kepulauan Belitung” merupakan salah satu syarat untuk meraih gelar sarjana di Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada pihak-pihak yang telah bersedia membantu dan memberi dukungan, diantaranya adalah:
1. Ibu Ir. Nurjanah, MS dan Ibu Asadatun Abdullah S.Pi, M.Si sebagai dosen-dosen pembimbing yang selalu memberikan bimbingan, arahan, saran dan motivasi kepada penulis dengan penuh kesabaran.
2. Ibu Dr. Tati Nurhayati, S.Pi, M.Si dan Ibu Desniar S.Pi, M.Si sebagai dosen-dosen penguji yang telah memberi pengarahan dan motivasi agar penulis dapat menyelasaikan skripsi dengan baik
3. Ibu Dr. Ir. Linawati Hardjito, MS selaku ketua Departemen Teknologi Hasil Perairan.
4. Bapak Dr. Ir. Agoes M. Jacoeb, Dipl. Biol selaku komisi pendidikan Departemen Teknologi Hasil Perairan.
5. Bapakku Supratikno dan mama Siti Arifah tersayang, terima kasih untuk doa, kasih sayang, perhatian, nasihat, restu yang tak terputus, dukungan moral dan materi sehingga penulis bisa membuktikan kemampuannya.
6. Mbak dan masku (Mbak Nink-Mas Aji, Mbak Yul-Mas Thierry) tercinta yang selalu memberikan doa, semangat, motivasi, dan materi sehingga penulis dapat mengembangkan diri selama menempuh ilmu di THP-FPIK, IPB. 7. Windo Sastra yang dan selalu memberikan doa, semangat, nasihat, bantuan,
kasih sayang dan bersedia menemani disaat senang ataupun sedih sehingga hidup semakin berwarna.
(7)
8. Keluarga besar Ibu Wiji Rahayu, S.Pd yang telah memberikan sambutan, bantuan dan tempat tinggal saat pengambilan sampel di Belitung.
9. Seluruh dosen dan staf Departemen THP, terima kasih atas kerja sama dan dukungannya.
10. Bu Ema dan Rita, terima kasih atas profesionalisme dan kerjasamanya sehingga penelitian ini dapat berjalan sesuai harapan.
11. Tyas, Uli, Uut, Pusse’, Prilisa, Seno, Pur, Anne, Vivit, Dewi, Anggi, Tya, Rodi, Rustam, Micha, Ale, serta temen-teman THP’42 lainnya, terima kasih atas bantuan, motivasi, pengertian, keceriaan, dan pengalaman berharga selama ini.
12. Kakak-kakak THP 41 (K’glory, Nichol, Mba’Eka, Mas An’im, K’Yogie, K’Dhika), serta adik-adik THP 43 dan 44 atas kebersamaan dan semangatnya. 13. Teman-temanku di “aLcaTraZ” (EmBe’, Othel, Windi, Trimi, Mbo’, Asti, Baki, Mamah, dan Pusse’) beserta alumninya (Putri, Fina dan Yuni) atas kebersamaan kita selama ini.
14. Terakhir, kepada berbagai pihak yang tidak disebutkan disini, penulis mengucapkan terima kasih banyak atas bantuan dan kerjasamanya dalam penulisan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa di dalam penulisan skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan. Oleh karena itu, kritik dan saran yang bersifat membangun dari semua pihak sangat penulis harapkan demi kemajuan penelitian selanjutnya. Akhir kata, semoga penulisan skripsi ini dapat bermanfaat dan memberikan informasi bagi semua pihak yang memerlukan.
Bogor, September 2009
Penulis
(8)
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Magelang pada tanggal 6 Maret 1988 sebagai anak terakhir dari tiga bersaudara,
putri pasangan Bapak Supratikno dan Ibu Siti Arifah. Pendidikan formal penulis dimulai dari TK Mutiara Jakarta dan lulus pada tahun 1992, kemudian melanjutkan pendidikan di SDN Kayumanis 01 Pagi Jakarta dan lulus pada tahun 1999. Pada tahun yang sama, penulis diterima di SLTPN 7 Jakarta dan lulus pada tahun 2002. Pendidikan selanjutnya ditempuh di SMUN 31 Jakarta dan lulus pada tahun 2005.
Penulis diterima di Institut Pertanian Bogor pada tahun 2005, Departemen Teknologi hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Selama masa perkuliahan, penulis aktif
menjadi pengurus Himpunan Mahasiswa Teknologi Hasil Perairan
(HIMASILKAN) dan Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan (BEM-C). Penulis juga pernah tercatat sebagai asisten mata kuliah Pengetahuan Bahan Baku 2008-2009.
Sebagai salah satu syarat meraih gelar sarjana, penulis melakukan penelitian yang berjudul "Ekstraksi Senyawa Aktif Antioksidan dari Lintah Laut (Discodoris sp.) asal Perairan Kepulauan Belitung". Dibimbing oleh Ibu
(9)
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ... viii
DAFTAR GAMBAR ... ix
DAFTAR LAMPIRAN ... x
1. PENDAHULUAN ... 1
1.1. Latar Belakang ... 1
1.2. Tujuan ... 3
2. TINJAUAN PUSTAKA ... 3
2.1. Lintah Laut (Discodoris sp.) ... 4
2.2. Radikal Bebas ... 6
2.3. Antioksidan ... 8
2.3.1. Fungsi antioksidan ... 8
2.3.2. Sumber antioksidan... 8
2.3.3. Mekanisme kerja antioksidan ... 9
2.4. Ekstraksi senyawa aktif ... 10
2.5. Uji Aktivitas Antioksidan ... 12
2.6. Senyawa Fitokimia ... 13
2.6.1. Alkaloid ... 13
2.6.2. Steroid/Triterpenoid ... 13
2.6.3. Flavonoid ... 14
2.6.4. Saponin... 15
2.6.5. Fenol hidrokuinon ... 15
2.6.6. Karbohidrat ... 16
2.6.7. Gula pereduksi ... 16
2.6.8. Peptida ... 17
2.6.9. Asam amino ... 17
3. METODOLOGI ... 18
3.1. Waktu dan Tempat ... 18
3.2. Bahan dan Alat ... 18
3.3. Metode Penelitian ... 18
3.3.1. Pengambilan dan preparasi bahan baku ... 19
3.3.2. Karakterisasi bahan baku ... 19
(10)
3.3.2.2. Uji proksimat ... 19
3.3.3. Ekstraksi komponen antioksidan ... 22
3.3.4. Ekstrak kasar ... 24
3.3.4.1. Uji aktivitas antioksidan (DPPH) ... 24
3.3.4.2. Uji fitokimia ... 24
3.4. Analisis Data ... 26
4. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 28
4.1. Karakteristik Bahan Baku ... 28
4.1.1. Rendemen ... 29
4.1.2. Kandungan gizi bahan baku ... 29
4.2. Ekstraksi Komponen Antioksidan... 32
4.3. Ekstrak Kasar ... 35
4.3.1. Aktivitas antioksidan ... 35
4.1.2. Senyawa fitokimia ... 41
5. KESIMPULAN DAN SARAN ... 45
5.1 Kesimpulan ... 45
5.2 Saran ... 45
DAFTAR PUSTAKA ... 46
(11)
DAFTAR TABEL
Nomor Teks Halaman
1. Sumber-sumber radikal bebas... 7
2. Beberapa pelarut organik dan sifat fisiknya ... 11
3. Hasil analisis proksimat lintah laut tanpa jeroan kering ... 30
4. Hasil uji aktivitas antioksidan ekstrak kasar lintah laut ... 36
(12)
DAFTAR GAMBAR
Nomor Teks Halaman
1. Lintah laut (Discodoris sp.) Perairan Kepulauan Belitung ... 5
2. Struktur DPPH dan DPPH tereduksi hasil reaksi dengan antioksidan ... 12
3. Diagram alir ekstraksi dengan pelarut etanol, metanol, dan aquabides ... 23
4. Lintah laut utuh segar, tanpa jeroan kering dan serbuknya ... 28
5. Ekstrak kasar lintah laut ... 34
6. Rendemen ekstrak kasar lintah laut... 34
7. Reaksi radikal bebas DPPH dengan ekstrak kasar lintah laut ... 37
8. Hubungan konsentrasi dengan persentase penghambatan BHT ... 37
9. Hubungan konsentrasi dengan rata-rata persentase penghambatan ekstrak kasar lintah laut... 38
(13)
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Halaman
1. Lokasi pengambilan lintah laut (Discodoris sp.) ... 50
2. Contoh perhitungan hasil proksimat ... 50
3. Data rendemen ekstrak kasar lintah laut... 51
4. Analisis sidik ragam rendemen ekstrak kasar lintah laut berdasarkan jenis pelarut ... 52
5. Contoh perhitungan konsentrasi uji aktivitas antioksidan ... 52
6. Contoh perhitungan nilai IC50 ... 53
7. Hasil uji aktivitas antioksidan ... 54
8. Analisis sidik ragam aktivitas antioksidan ekstrak kasar lintah laut berdasarkan jenis pelarut ... 55
(14)
1. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Kondisi dunia yang semakin maju dengan berbagai teknologi telah mendorong penghuninya menjadi manusia modern. Pola hidup manusia yang modern memiliki kesadaran yang rendah terhadap pemeliharaan kesehatan dan lingkungannya, contohnya penggunaan berbagai fasilitas yang dapat menimbulkan polusi udara. Pencemaran udara kota-kota besar di Indonesia saat ini telah melebihi standar yang ditetapkan Organisasi Kesehatan Dunia (WHO), yaitu 50 mikrogram per meter kubik (ìg/m3) (PDPERSI 2009). Pencemaran udara yang telah melebihi standar WHO sangat rawan dalam menimbulkan berbagai gangguan pada kesehatan.
Sumber polusi dapat berasal dari kendaraan bermotor, industri, asap rokok, mesin fotocopy, pendingin ruangan maupun kebakaran hutan. Tingkat polusi yang tinggi dapat menjadi salah satu pemicu terbentuknya radikal bebas sebagai produk samping dari proses respirasi dan metabolisme normal tubuh. Senyawa radikal bebas juga dapat terbentuk dalam tubuh melalui proses oksidasi yang berlangsung pada waktu bernapas, olah raga yang berlebihan maupun peradangan.
Radikal bebas adalah senyawa kimia yang memiliki satu atau lebih elektron tidak berpasangan di kulit terluar sehingga sangat reaktif dan mampu bereaksi dengan protein, lipid, atau DNA. Reaksi antara radikal bebas dan molekul tersebut dapat berujung pada timbulnya suatu penyakit (Sofia 2008). Radikal bebas pada awalnya diperlukan untuk membunuh mikroorganisme penyebab infeksi dalam tubuh makhluk hidup. Paparan radikal bebas yang berlebihan dan secara terus-menerus dapat menyebabkan kerusakan sel, mengurangi kemampuan sel untuk beradaptasi terhadap lingkungannya, dan pada akhirnya dapat menyebabkan kematian sel yang memicu terjadinya berbagai jenis penyakit degeneratif seperti jantung koroner, tekanan darah tinggi, aterosklerosis, kencing manis dan kanker (PDPERSI 2009). Reaktivitas radikal bebas ini dapat diredam oleh senyawa antioksidan.
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksidasi molekul lain. Senyawa antioksidan ini akan menyerahkan satu atau lebih
(15)
elektronnya kepada radikal bebas sehingga dapat menghentikan kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas. Di dalam tubuh terdapat mekanisme antioksidan atau antiradikal bebas secara endogenik. Tetapi bila jumlah radikal bebas dalam tubuh berlebih maka dibutuhkan antioksidan yang berasal dari luar tubuh (eksogenik) (Pratiwi et al. 2006).
Antioksidan sintetik yang berkembang saat ini dikhawatirkan dapat memberi efek samping yang berbahaya bagi kesehatan manusia. Tubuh manusia mempunyai batasan maksimum dalam mentolerir seberapa banyak konsumsi bahan tambahan makanan setiap hari yang disebut ADI atau Acceptable Daily Intake. Nilai ADI untuk BHT adalah sebesar 0-0,3 mg/kg bw (WHO 1999; D’Mello 2003). Kadar maksimum BHT dalam bahan pangan adalah 200 ppm (Ketaren 1986). Penggunaan antioksidan sintetik pada manusia dalam jangka
panjang dan jumlah berlebihan dapat menyebabkan kerusakan hati (Ford et al. 1980 diacu dalamNurhikmah 2006). Potensi antioksidan alami harus
dikembangkan untuk memperoleh antioksidan yang lebih aman dikonsumsi. Salah satu sumber daya perairan yang berpotensi sebagai penghasil antioksidan alami adalah lintah laut (Discodoris sp.).
Lintah laut merupakan anggota kelompok filum mollusca yang tidak memiliki cangkang. Fungsi dari cangkang digantikan oleh sistem perlindungan kimia berupa senyawa aktif dalam tubuhnya (Davies-coleman 2006). Senyawa aktif ini digunakan lintah laut untuk melindungi diri dari serangan predator maupun gangguan di lingkungannya.
Masyarakat Bajo di Pulau Buton biasa mengkonsumsi lintah laut sebagai aprodisiaka dan peningkat stamina tubuh. Penelitian sebelumnya telah dilakukan
terhadap lintah laut yang berasal dari Pulau Buton. Hasil penelitian Ibrahim (2001) menunjukkan bahwa lintah laut mengandung steroid yang
memiliki aktivitas androgenik dan anabolik. Penelitian Witjaksono (2005) menunjukkan bahwa ekstrak dan minyak dari lintah laut mengandung sterol, asam lemak jenuh dan asam lemak tak jenuh. Nurjanah (2009) menambahkan bahwa lintah laut yang berasal dari perairan Pulau Buton mengandung antioksidan dan antikolesterol yang tinggi.
(16)
Lintah laut tidak hanya terdapat pada Perairan Pulau Buton. Perairan Kepulauan Belitung juga memiliki lintah laut yang dikenal dengan nama “inal-inal”, namun sebagian besar masyarakatnya belum mengetahui akan keberadaan dan potensi yang dimiliki lintah laut. Hal tersebut mendasari penelitian ini untuk mengetahui potensi antioksidan yang terdapat dalam lintah laut dari Perairan Kepulauan Belitung. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memperkaya informasi mengenai kandungan senyawa antioksidan lintah laut yang dapat bermanfaat untuk bidang pangan, farmasi maupun industri lainnya.
1.2. Tujuan
Tujuan dari penelitian ini adalah (1) mempelajari karakteristik lintah laut (Discodoris sp.) dari Perairan Kepulauan Belitung, (2) mempelajari pengaruh perbedaan jenis pelarut terhadap persentase rendemen dan aktivitas antioksidan ekstrak kasar lintah laut, dan (3) menentukan komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar lintah laut.
(17)
2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Lintah Laut (Discodoris sp.)
Lintah laut (Discodoris sp.) merupakan anggota dari kelompok ordo Nudibranchia. Kata Nudibranch berasal dari Bahasa latin nudus yang berarti telanjang dan bahasa Yunani brankhia yang berarti insang. Nudibranch tidak memiliki cangkang, sehingga menggunakan senyawa kimia dalam tubuhnya untuk mempertahankan diri. Kelompok hewan ini memiliki corak dan warna yang beraneka ragam, namun beberapa jenis dari hewan ini mempunyai kemampuan kamuflase yang handal sehingga cukup sulit untuk ditemukan (Sorowako 2008).
Klasifikasi lintah laut secara sistematik menurut Rudman (1999) adalah sebagai berikut:
Kingdom : Animal
Phylum : Molusca
Kelas : Gastropoda
Sub Kelas : Opistobranchia
Ordo : Nudibranchia
Sub Ordo : Doridina
Famili : Dorididae
Genus : Discodoris sp.
Lintah laut (Discodoris sp.) adalah spesies yang banyak ditemukan di kepulauan Philipina, Papua New Geunia, Indonesia, Okinawa, Afrika Selatan, dan Australia. Hewan ini memiliki tubuh yang berwarna coklat kehitam-hitaman dengan bintik putih dan garis pada bagian atas badannya. Permukaan tubuhnya licin dan tidak dilindungi oleh lapisan pelindung. Insang-insangnya berjumbaian di punggung, selain itu hewan ini memiliki kepala bertentakel yang sangat sensitif terhadap sentuhan, rasa dan bau. Matanya yang kecil hanya bisa melihat sedikit selain membedakan terang dan gelap (Sorowako 2008). Morfologi lintah laut (Discodoris sp.) dapat dilihat pada Gambar 1.
(18)
Gambar 1. Lintah laut (Discodoris sp.) Perairan Kepulauan Belitung Lintah laut biasanya terdapat di perairan dangkal berpasir serta terumbu karang hingga di dasar laut kelam lebih dari satu kilometer dalamnya, nudibranch berkembang biak baik di perairan hangat maupun dingin dan bahkan di sekeliling cerobong-cerobong vulkanis yang menyembur di laut dalam (Holland 2009). Hewan ini hidup dan menempel rapat pada batu-batuan yang berlumpur atau berpasir dan menghasilkan lendir (mucus) untuk mencegah kekeringan. Bagian bawahnya dapat bergerak dan menempel pada substrat sehingga gerakannya lambat (Rudman 1999).
Lintah laut temasuk hewan herbivora, makanannya adalah berbagai alga baik yang berukuran kecil (fitoplankton/mikroalga) maupun yang berukuran besar makroalga/rumput laut yang terdiri dari rumput laut coklat (Paeophyceae), merah (Rodophyceae), dan hijau (Chlorophyceae). Racun yang terdapat pada mangsanya tidak membahayakan hewan ini, melainkan dapat digunakan sebagai suatu alat pertahanan terhadap musuh. Banyak nudibranch yang dapat berpindah dari lokasi pencarian makanan yang satu ke yang lain (Holland 2009).
Kelompok hewan Nudibranch lebih suka menyendiri, dengan kebiasaan nokturnal serta wilayah pengembaraan yang sempit. Nudibranch dapat melakukan kamuflase mulai dari warna kusam hingga cemerlang, bukan warna-warna kontras. Pigmen warnanya mirip spons dipengaruhi oleh substrat edibel tempat mereka berdiam hewan ini mencium, mengecap, dan merasakan dunia dengan menggunakan tonjolan-tonjolan sensor di kepala yang disebut rhinophore dan tentakel-tentakel oral. Sinyal-sinyal kimia digunakan untuk membantu menemukan makanan (Holland 2009).
(19)
Nudibranch temasuk hewan hermaprodit, yaitu hewan yang memiliki organ jantan maupun betina dalam satu individu serta membuahi sesamanya. Tergantung spesies, pasangan nudibranch meletakkan telurnya dalam bentuk spiral, pita, atau rumpun kusut, berjumlah dua juta sekali bertelur, namun tidak semua pembuahannya berhasil (Holland 2009). Ketika organisme ini siap untuk kawin akan bermigrasi ke daerah pantai yang berbatu dan ditumbuhi subur oleh tanaman alga atau rumput laut dan menyemprotkan telur dan sperma sekaligus di sekitar bebatuan tersebut. Telur-telur tersebut akan dibiarkan melayang di sekitar bebatuan agar terhindar dari predator dan dibiarkan menetas sendiri (Rudman 1983 diacu dalamWitjaksono 2005).
2.2. Radikal Bebas
Radikal bebas adalah atom atau gugus atom yang memiliki satu atau lebih elektron tak berpasangan. Adanya elektron tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan. Radikal ini akan merebut elektron dari molekul lain yang ada disekitarnya untuk menstabilkan diri, sehingga senyawa kimia ini sering dihubungkan dengan terjadinya kerusakan sel, kerusakan jaringan, dan proses penuaan (Fessenden dan Fessenden 1986).
Radikal bebas memiliki reaktivitas yang sangat tinggi. hal ini ditunjukkan oleh sifatnya yang segera menarik atau menyerang elektron di sekelilingnya. Reaktivitas radikal bebas merupakan upaya untuk mencari pasangan elektron. Sebagai dampak dari kerja radikal bebas tersebut, akan terbentuk radikal bebas baru yang berasal dari atom atau molekul yang elektronnya diambil untuk berpasangan dengan radikal sebelumnya. Namun, bila dua senyawa radikal bertemu, elektron-elektron yang tidak berpasangan dari kedua senyawa tersebut akan bergabung dan membentuk ikatan kovalen yang stabil. Sebaliknya, bila senyawa radikal bebas bertemu dengan senyawa yang bukan radikal bebas akan terjadi tiga kemungkinan, yaitu (1) radikal bebas akan memberikan elektron yang tidak berpasangan (reduktor) kepada senyawa bukan radikal bebas, (2) radikal bebas menerima elektron (oksidator) dari senyawa bukan radikal bebas, (3) radikal bebas bergabung dengan senyawa bukan radikal bebas (Winarsi 2007).
Mekanisme reaksi radikal bebas digambarkan sebagai suatu deret reaksi-reaksi bertahap. Tahapan mekanisme reaksi-reaksi tersebut diawali dengan pembentukan
(20)
awal radikal bebas (inisiasi), lalu perambatan atau terbentuknya radikal baru (propagasi), dan tahap terakhir (terminasi), yaitu pemusnahan atau pengubahan menjadi radikal bebas stabil dan tak reaktif (Fessenden dan Fessenden1986).
Radikal bebas dapat terbentuk melalui dua cara, yaitu secara endogen (sebagai respon normal proses biokimia internal maupun eksternal) dan secara eksogen (berasal dari polusi, makanan, serta injeksi ataupun absorpsi melalui injeksi) (Winarsi 2007). Radikal bebas juga dapat terbentuk dari senyawa lain yang sebenarnya bukan radikal bebas, tetapi mudah berubah menjadi radikal bebas. Sumber-sumber radikal bebas yang berasal dari faktor endogen maupun eksogen dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Sumber-sumber radikal bebas
Sumber endogen Sumber eksogen
Mitokondria Fagosit
Xantin oksidase
Reaksi yang melibatkan logam transisi Jalur arakhidonat
Peroksisom Olahraga Peradangan Iskemia/reperfusi
Rokok
Polutan lingkungan Radiasi
Obat-obatan tertentu, pestisida dan anestesi dan larutan industri Ozon
Sumber: Tuminah (2000)
Radikal bebas dalam jumlah berlebih di dalam tubuh sangat berbahaya karena menyebabkan kerusakan sel, asam nukleat, protein dan jaringan lemak. Radikal bebas terbentuk di dalam tubuh akibat produk sampingan proses metabolisme ataupun karena terdapat radikal bebas dalam tubuh melalui pernapasan (Dalimarta dan Soedibyo 1998 diacu dalamPratiwi et al. 2006). Akan tetapi, radikal bebas tidak selalu merugikan. Misalnya, radikal bebas berperan dalam pencegahan penyakit yang disebabkan karena mikrobia melalui sel-sel darah khusus yang disebut fagosit (Tuminah 2000).
(21)
2.3. Antioksidan
Dalam pengertian kimia, senyawa antioksidan adalah senyawa pemberi elektron (electron donor). Secara biologis, pengertian antioksidan adalah senyawa yang mampu menangkal atau meredam dampak negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisa dihambat (Winarsi 2007).
2.3.1. Fungsi antioksidan
Antioksidan berfungsi untuk menetralisasi radikal bebas, sehingga atom dan elektron yang tidak berpasangan mendapatkan pasangan elektron dan menjadi stabil. Keberadaan antioksidan dapat melindungi tubuh dari berbagai macam penyakit degeneratif dan kanker. Selain itu antioksidan juga membantu menekan proses penuaan/antiaging (Tapan 2005).
2.3.2. Sumber antioksidan
Sumber-sumber antioksidan dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok, yaitu antioksidan alami (antioksidan hasil ekstraksi bahan alami) dan antioksidan sintetik (antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesa reaksi kimia). Senyawa-senyawa yang umumnya terkandung dalam antioksidan alami adalah fenol, polifenol, dan yang paling umum adalah flavonoid (flavonol, isoflavon, flavon, katekin, flavonon), turunan asam sinamat, tokoferol, dan asam organik polifungsi. Saat ini tokoferol sudah diproduksi secara sintetik untuk tujuan komersil (Pratt dan Hudson 1990).
Antioksidan sintetik ditambahkan ke dalam bahan pangan untuk mencegah ketengikan. Antioksidan sintetik yang banyak digunakan sekarang adalah senyawa-senyawa fenol yang biasanya agak beracun. Oleh karena itu penambahan antioksidan ini harus memenuhi beberapa persyaratan, misalnya tidak berbahaya bagi kesehatan, tidak menimbulkan warna yang tidak diinginkan, efektif pada konsentrasi rendah, larut dalam lemak, mudah didapat, dan ekonomis. Empat macam antioksidan sintetik yang sering digunakan adalah Butylated hydroxyanisole (BHA), Butylated hydroxytoluene (BHT), Propylgallate (PG), dan
(22)
2.3.3. Mekanisme kerja antioksidan
Aktivitas penghambatan antioksidan dalam reaksi oksidasi berdasarkan keseimbangan reaksi keseimbangan reaksi oksidasi reduksi. Molekul antioksidan akan bereaksi dengan radikal bebas (R*) dan membentuk molekul yang tidak reaktif (RH) dan dengan demikian reaksi berantai pembentukan radikal bebas dapat dihentikan (Belitz dan Grosch 1999).
Antioksidan yang baik akan bereaksi dengan radikal bebas segera setelah senyawa tersebut terbentuk. Mekanisme antioksidan dalam menghambat oksidasi atau menghentikan reaksi berantai pada radikal bebas dari lemak yang teroksidasi, dapat disebabkan oleh 4 macam mekanisme reaksi (Ketaren 1986), yaitu (1) pelepasan hidrogen dari antioksidan, (2) pelepasan elektron dari antioksidan, (3) addisi lemak ke dalam cincin aromatik pada antioksidan, dan (4) pembentukan senyawa kompleks antara lemak dan cincin aromatik dari antioksidan.
Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan digolongkan menjadi tiga kelompok, yaitu antioksidan primer, sekunder, dan tersier. Antioksidan primer disebut juga antioksidan endogenus atau enzimatis. Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan primer apabila dapat memberikan atom hidrogen secara cepat kepada senyawa radikal, kemudian radikal antioksidan yang terbentuk segera berubah menjadi senyawa yang lebih stabil. Antioksidan primer meliputi enzim superoksida dismutase (SOD), katalase, dan glutation peroksidase. Sebagai antioksidan, enzim-enzim tersebut menghambat pembentukan radikal bebas dengan cara memutus reaksi berantai (polimerisasi), kemudian mengubahnya menjadi produk yang lebih stabil (Winarsi 2007).
Antioksidan sekunder disebut juga antioksidan eksogenus atau non-enzimatis. Antioksidan kelompok ini juga disebut sistem pertahanan preventif dimana terbentuknya senyawa oksigen reaktif dihambat dengan cara pengkelatan metal, atau dirusak pembentukannya. Kerja antioksidan sekunder yaitu dengan cara memotong reaksi oksidasi berantai dari radikal bebas atau dengan cara menangkapnya. Antioksidan sekunder meliputi vitamin e, vitamin C, -karoten, flavonoid, asam urat, bilirubin, dan albumin (Winarsi 2007).
Kelompok antioksidan tersier meliputi sistem enzim DNA-repair dan metionin sulfoksida reduktase. Enzim-enzim ini berfungsi dalam perbaikan
(23)
biomolekuler yang rusak akibat reaktivitas radikal bebas. Kerusakan DNA yang terinduksi senyawa radikal bebas dicirikan oleh rusaknya single dan double stand, baik gugus basa maupun non-basa (Winarsi 2007).
Dari berbagai jenis antioksidan yang ada, mekanisme kerja serta kemampuannya sebagai antioksidan sangat bervariasi. Seringkali, kombinasi beberap jenis antioksidan memberikan perlindungan yang lebih baik (sinergisme) terhadap oksidasi dibandingkan dengan satu jenis antioksidan saja (Siagian 2002).
2.4. Ekstraksi Senyawa Aktif
Ekstraksi adalah suatu cara untuk memisahkan campuran beberapa zat menjadi komponen-komponen yang terpisah (Winarno et al. 1973). Harbone (1987) menambahkan bahwa ekstraksi adalah proses penarikan komponen atau zat aktif suatu simplisia dengan menggunakan pelarut tertentu. Proses ekstraksi bertujuan mendapatkan bagian-bagian tertentu dari bahan yang mengandung komponen-komponen aktif.
Metode ekstraksi yang digunakan tergantung dari beberapa faktor, antara lain tujuan ekstraksi, skala ekstraksi, sifat-sifat komponen yang akan diekstrak dan sifat-sifat pelarut yang digunakan. Metode umum ekstraksi yang dapat dilakukan terdiri dari ekstraksi dengan pelarut, destilasi, supercritical fluid extraction (SFE), pengepresan mekanik dan sublimasi. Diantara metode-metode yang telah dilakukan, metode yang banyak digunakan adalah destilasi dan ekstraksi menggunakan pelarut (Houghton dan Raman 1998).
Ekstraksi menggunakan pelarut dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu
aqueous phase dan organic phase. Ekstraksi aqueous phase dilakukan dengan menggunakan pelarut air, sedangkan organic phase menggunakan pelarut organik (Winarno et al. 1973). Prinsip metode ekstraksi menggunakan pelarut organik adalah bahan yang akan diekstrak kontak langsung dengan pelarut pada waktu tertentu kemudian diikuti dengan pemisahan dari bahan yang telah diekstrak (Houghton dan Raman 1998).
Suatu senyawa menunjukkan kelarutan yang berbeda-beda dalam pelarut yang berbeda. Bahan dan senyawa kimia akan mudah larut pada pelarut yang relatif sama kepolarannya. Derajat polaritas tergantung pada tahapan dielektrik, makin besar tahapan dielektrik semakin polar pelarut tersebut (Nur dan
(24)
Adijuwana 1989). Beberapa pelarut organik dan sifat fisiknya dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Beberapa pelarut organik dan sifat fisiknya
Pelarut Titik didih
(oC)
Titik beku (oC) Konstanta
dielektrik (Debye) Dietil eter Karbon disulfide Aseton Kloroform Metanol Tetrahidrofuran Di-isopropil eter N-heksan Karbon Tetraklorida Etil asetat Etanol Benzena Sikloheksana Isopropanol Air Dioksan Toluena
Asam asetat glasial N,N-dimetil formamida Dietilenaglikol 35 46 56 61 65 66 68 69 76 77 78 80 81 82 100 102 111 118 154 245 -116 -111 -95 -64 -98 -65 -60 -94 -23 -84 -117 5,5 5,5 -89 0 12 -95 17 -61 -10 4,3 2,6 20,7 4,8 32,6 7,6 3,9 1,9 2,2 6,0 24,3 2,3 2,0 18,3 78,5 2,2 2,4 6,2 34,8 37,7
Sumber: Nur dan Adijuwana (1989)
Pelarut yang bersifat polar, mampu mengekstrak senyawa alkaloid kuartener, komponen fenolik, karotenoid, tannin, gula, asam amino, dan glikosida (Harborne 1987). Hasil ekstrak yang diperoleh akan tergantung pada beberapa faktor antara lain kondisi alamiah senyawa tersebut, metode ekstraksi yang digunakan, ukuran partikel sampel, kondisi dan waktu penyimpanan, lama waktu ekstraksi, dan perbandingan jumlah pelarut terhadap jumlah sampel (Darusman et al. 1995).
Jenis dan mutu pelarut yang digunakan menentukan keberhasilan proses ekstraksi. Pelarut yang digunakan harus dapat melarutkan zat yang diinginkannya, mempunyai titik didih yang rendah, murah, tidak toksik, dan mudah terbakar (Ketaren 1986). Selain itu, keberhasilan ekstraksi juga tergantung pada banyaknya ekstraksi yang dilakukan. Hasil yang baik diperoleh jika ekstraksi dilakukan
(25)
berulang-ulang dengan jumlah pelarut yang sedikit-sedikit. Efisiensi ekstraksi dapat ditingkatkan dengan menggunakan luas kontak yang besar (Khopkar 2003).
2.5. Uji Aktivitas Antioksidan
Metode yang umum digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan suatu bahan adalah dengan menggunakan radikal bebas diphenylpicrylhydrazyl (DPPH). DPPH adalah radikal bebas yang bersifat stabil dan beraktivitas dengan cara mendelokasi elektron bebas pada suatu molekul, sehingga molekul tersebut tidak reaktif sebagaimana radikal bebas yang lain. Proses delokalisasi ini ditunjukkan dengan adanya warna ungu (violet) pekat yang dapat dikarakterisasi pada pita absorbansi (Molyneux 2004).
Pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH menggunakan prinsip spektrofotometri. Senyawa DPPH (dalam metanol) berwarna ungu tua terdeteksi pada panjang gelombang sinar tampak sekitar 517 nm. Suatu senyawa dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan apabila senyawa tersebut mampu mendonorkan atom hidrogennya untuk berikatan dengan DPPH membentuk DPPH tereduksi, ditandai dengan semakin hilangnya warna ungu (menjadi kuning pucat) (Molyneux 2004). Prinsip penurunan nilai absorbansi digunakan untuk mengetahui kapasitas antioksidan suatu senyawa. Struktur DPPH dan DPPH tereduksi hasil reaksi dengan antioksidan dapat dilihat pada Gambar 2.
Diphenylpicrylhydrazyl (radikal bebas) Diphenylpicrylhydrazine (non radikal) Gambar 2. Struktur DPPH dan DPPH tereduksi hasil reaksi dengan antioksidan
Parameter untuk menginterpretasikan hasil pengujian dengan metode DPPH adalah IC50 (inhibition concentration). IC50 merupakan konsentrasi larutan
substrata atau sampel yang akan menyebabkan reduksi terhadap aktivitas DPPH sebesar 50 % (Molyneux 2004). Semakin kecil nilai IC50 berarti semakin tinggi
(26)
sangat kuat jika nilai IC50 kurang dari 0,05 mg/ml, kuat untuk IC50 antara
0,05-0,1 mg/ml, sedang jika IC50 bernilai 0,101-0,150 mg/ml, dan lemah jika IC50
bernilai 0,150-0,200 mg/ml.
2.6. Senyawa Fitokimia
Fitokimia adalah cabang ilmu yang mempelajari senyawa organik yang dibentuk dan ditimbun oleh tumbuhan, yaitu mencakup struktur kimia, biosintesis, perubahan serta metabolisme, penyebaran secara alami, dan fungsi biologis. Senyawa fitokimia bukanlah zat gizi, namun kehadirannya dalam tubuh dapat membuat tubuh lebih sehat, lebih kuat dan lebih bugar (Astawan dan Kasih 2008). Senyawa fitokimia berpotensi mencegah bebagai penyakit seperti penyakit degeneratif dan kardiovaskuler (Harborne 1987).
2.6.1. Alkaloid
Alkaloid adalah senyawa kimia tanaman hasil metabolit sekunder yang terbentuk berdasarkan prinsip pembentukan campuran (Sirait 2007). Pada umumnya alkaloid merupakan senyawa yang bersifat basa (adanya gugus amino) yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen dalam bentuk gabungan sebagai bagian dari sistem siklik (Harborne 1987).
Kelompok senyawa alkaloid terdiri dari alkaloid sesungguhnya, protoalkaloid, dan pseudoalkaloid. Alkaloid sesungguhnya adalah racun, senyawa tersebut menunjukkan aktivitas phisiologi yang luas, hampir tanpa terkecuali bersifat basa, lazim mengandung nitrogen dalam cincin heterosiklis, diturunkan dari asam amino, dan biasanya terdapat dalam tanaman sebagai garam asam organik. Protoalkaloid merupakan amin yang relatif sederhana dimana dalam nitrogen asam amino tidak terdapat cincin heterosiklis, dan diperoleh berdasarkan biosintesis dari asam amino yang bersifat basa. Pseudoalkaloid tidak diturunkan dari prekursor asam amino, dan biasanya senyawa ini bersifat basa (Sastrohamidjojo 1996).
2.6.2. Steroid/Triterpenoid
Triterpenoid adalah senyawa dengan kerangka karbon yang disusun dari 6 unit isoprena dan dibuat secara biosintesis dari skualen, suatu C30 hidrokarbon
siklik. Senyawa tersebut tidak berwarna, kristalin, sering mempunyai titik lebur tinggi, umumnya sulit untuk dikarakterisasi karena secara kimia tidak reaktif.
(27)
Triterpenoid dapat dibagi menjadi empat kelompok senyawa, yaitu triterpen sebenarnya, steroid, saponin, dan glikosida jantung (cardiac glycoside). Beberapa triterpen dikenal dengan rasanya, terutama rasa pahit (Sirait 2007).
Steroid merupakan golongan dari senyawa triterpenoid. Hormon steroid dalam mamalia dibiosintesis dari kolesterol. Steroid berupa padatan kristal yang berwarna putih dan dapat berbentuk jarum kecil, lembaran, lempengan atau partikel amorf tergantung pelarut yang digunakan dalam kristalisasi. Steroid mempunyai 17 atom karbon atau lebih sehingga golongan senyawa ini cenderung tidak larut dalam air (Wilson dan Gisvold 1982).
2.6.3. Flavonoid
Senyawa flavonoid adalah senyawa yang mengandung C15 terdiri atas dua
inti fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon. Cincin A memiliki karakteristik bentuk hidroksilasi phloroglusinol atau resorsinol, dan cincin B biasanya 4-,3,4-, atau 3,4,5-terhidroksilasi (Sastrohamidjojo 1996).
Flavonoid terdapat dalam tumbuhan, terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon flavonoid. Penggolongan jenis flavonoid dalam jaringan tumbuhan
mula-mula didasarkan pada telaah sifat kelarutan dan reaksi warna (Harbone 1987). Flavonoid dapat diklasifikasikan menjadi flavon, flavonol,
flavonon, flavononon, isoflavon, calkon, dihidrokalkon, auron, antosianidin, katekin, dan flavan-3,4-diol (Sirait 2007).
Flavonoid memberikan konstribusi keindahan dan kesemarakan pada buah-buahan di alam. Flavon memberikan warna kuning atau jingga, antosianin memberikan warna merah, ungu atau biru, yaitu semua warna yang terdapat pada pelangi kecuali warna hijau (Sastrohamidjojo 1996). Flavonoid pada tumbuhan berfungsi dalam pengaturan tumbuh, pengaturan fotosintesis, kerja antimikroba dan antivirus, dan kerja terhadap serangga (Robinson 1995).
Kegunaan flavonoid juga ditemukan dalam kehidupan manusia. Flavon bekerja sebagai stimulan pada jantung, hesperidin mempengaruhi pembuluh darah kapiler. Flavon terhidroksilasi bekerja sebagai diuretik dan sebagai antioksidan pada lemak (Sirait 2007).
(28)
2.6.4. Saponin
Saponin adalah senyawa aktif permukaan kuat yang menimbulkan busa jika dikocok dalam air dan pada konsentrasi rendah sering menyebabkan hemolisis sel darah merah (Robinson 1995). Sifatnya sebagai senyawa aktif permukaan disebabkan adanya kombinasi antara aglikon lipofilik dengan gula yang bersifat hidrofilik (Houghton dan Raman 1998).
Terdapat dua jenis saponin, yaitu glikosida triterpenoid alkohol dan glikosida struktur steroid tertentu yang mempunyai rantai samping spiroketal. Kedua jenis ini larut dalam air dan etanol tetapi tidak larut dalam eter. Aglikonnya yang disebut sapogenin diperoleh dengan hidrolisis dalam suasana asam atau hidrolisis memakai enzim, dan tanpa bagian gula ciri kelarutannya sama dengan ciri sterol lain (Robinson 1995).
Saponin menyebabkan stimulasi pada jaringan tertentu misalnya, pada epitel hidung, bronkus, ginjal, dan sebagainya. Stimulasi pada ginjal diperkirakan menimbulkan efek diuretika. Sifat menurunkan tegangan muka yang ditimbulkan oleh saponin dapat dihubungkan dengan daya ekspektoransia. Dengan sifat ini lendir akan dilunakkan atau dicairkan. Saponin bisa juga sebagai prekursor hormon steroid (Sirait 2007).
2.6.5. Fenol hidrokuinon
Fenol meliputi berbagai senyawa yang berasal dari tumbuhan dan mempunyai ciri sama yaitu cincin aromatik yang mengandung satu atau dua gugus hidroksil. Flavonoid merupakan golongan fenol yang terbesar, selain itu juga terdapat fenol monosiklik sederhana, fenilpropanoid, dan kuinon fenolik (Harborne 1987).
Kuinon adalah senyawa berwarna dan mempunyai kromofor dasar, seperti kromofor pada benzokuinon, yang terdiri atas dua gugus karbonil yang berkonjugasi dengan dua ikatan rangkap karbon-karbon. Untuk tujuan identifikasi, kuinon dapat dibagi menjadi empat kelompok, yaitu benzokuinon, naftokuinon, antrakuinon dan kuinon isoprenoid. Tiga kelompok pertama biasanya terhidroksilasi dan bersifat senyawa fenol (Harborne 1987).
Polifenol memiliki kemampuan untuk berikatan dengan metabolit lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat membentuk senyawa kompleks yang stabil
(29)
sehingga menghambat mutagenesis dan karsinogenesis. Selain itu, polifenol memiliki sifat antioksidatif dan antitumor (Mukhopadhiay 2000).
2.6.6. Karbohidrat
Karbohidrat merupakan sumber energi utama bagi manusia dan hewan yang berasal dari tumbuh-tumbuhan. Melalui proses fotosintesis, klorofil tanaman dengan sinar matahari mampu membentuk karbohidrat dari karbon dioksida (CO2)
yang berasal dari udara dan air dari tanah. Proses fotosintesis menghasilkan
karbohidrat sederhana glukosa dan oksigen yang dilepas di udara (Almatsier 2006).
Karbohidrat dapat dikelompokkan menjadi monosakarida, oligosakarida serta polisakarida. Monosakarida merupakan suatu molekul yang dapat terdiri dari lima atau enam atom C, sedangkan oligosakarida merupakan polimer dari 2-10 monosakarida, dan pada umumnya polisakarida merupakan polimer yang terdiri lebih dari 10 monomer monosakarida (Winarno 1997).
Karbohidrat mempunyai peranan penting untuk mencegah pemecahan protein tubuh yang berlebihan yang berakibat kepada penurunan fungsi protein sebagai enzim dan fungsi antibodi, timbulnya ketosis, kehilangan mineral dan berguna untuk membantu metabolisme lemak dan protein (Budiyanto 2002).
2.6.7. Gula pereduksi
Sifat pereduksi dari suatu molekul gula ditentukan oleh ada atau tidaknya gugus hidroksil (OH) bebas yang reaktif. Gugus hidroksil yang reaktif pada glukosa (aldosa) biasanya terletak pada karbon nomor satu (anomerik), sedangkan pada fruktosa (ketosa) terletak pada karbon nomor dua. Sukrosa tidak mempunyai gugus OH bebas yang reaktif karena keduanya sudah saling terikat, sedangkan laktosa mempunyai OH bebas pada atom C nomor satu pada gugus glukosanya (Winarno 1997).
Sifat sebagai reduktor pada monosakarida dan beberapa disakarida disebabkan oleh adanya gugus aldehida atau keton bebas dalam molekul karbohidrat. Sifat ini dapat digunakan untuk keperluan identifikasi karbohidrat maupun analisis kuantitatif. Pereaksi Benedict berupa larutan yang mengandung kuprisulfat, natrium karbonat dan natrium sitrat. Glukosa dapat mereduksi ion Cu2+ dari kuprisulfat menjadi ion Cu+ yang kemudian mengendap sebagai Cu2O.
(30)
Adanya natrium karbonat dan natrium sitrat membuat pereaksi Benedict bersifat basa lemah. Endapan yang terbentuk dapat berwarna hijau, kuning atau merah bata. Warna endapan ini tergantung pada konsentrasi karbohidrat yang diperiksa (Poedjiadi 1994).
2.6.8. Peptida
Peptida merupakan hasil polikondensasi asam amino. Gugus karbonil dari satu asam amino berikatan dengan gugus asam amino lain membentuk ikatan amida atau ikatan peptida. Pengertian peptida biasanya untuk menyatakan polimer yang memiliki berat molekul lebih rendah dari 5000. Peptida dapat dihidrolisis sebagian menjadi protein, juga senyawa yang mengandung asam amino non-protein (Sastrohamidjojo 1996).
Dipeptida diturunkan dari dua asam amino tripeptida dari tiga asam amino, dan seterusnya. Siklisasi dipeptida menghasilkan 2,5-dioksopi-perazin dan senyawa sejenisnya sering disintesis oleh mikroorganisme (Sastrohamidjojo 1996). Dipeptida masih mempunyai gugus amino dan karboksil bebas sehingga dapat bereaksi dengan dipeptida-dipeptida lain membentuk polipeptida dan akhirnya membentuk molekul protein (Winarno 1997).
2.6.9. Asam amino
Asam amino adalah asam karboksilat yang mempunyai sekurang-kurangnya satu gugus amino. Kebanyakan asam amino alam mempunyai rumus umum RCH(NH3+)CO2- (Robinson 1995). Semua asam amino berkonfigurasi á
dan mempunyai konfigurasi L kecuali glisin yang tidak mempunyai atom C asimetrik. Hanya asam amino L yang merupakan komponen protein (Winarno 1997).
Sebagian besar sifat fisika asam amino ditentukan oleh struktur ion dwikutub. Kelompok asam amino lebih mudah larut dalam air daripada dalam pelarut organik. Asam amino membentuk garam dengan asam atau basa karena bersifat amfoter (Robinson 1995). Derajat ionisasi dari asam amino sangat dipengaruhi oleh pH. Pada pH yang rendah misalnya pada pH 1,0 gugus karboksilnya tidak terdisosiasi, sedang gugus aminonya menjadi ion. Pada pH yang tinggi misalnya pada pH 11,0 karboksilnya terdisosiasi sedang gugusan aminonya tidak (Winarno 1997).
(31)
3. METODOLOGI
3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan April sampai Juli 2009. Lintah laut diambil dari perairan Tanjung Binga Kepulauan Belitung. Analisis lintah laut bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Laboratorium Biologi Hewan, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi-LPPM, serta Laboratorium Basah Pusat Studi Biofarmaka, Institut Pertanian Bogor.
3.2. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan antara lain pisau, timbangan digital, timbangan analitik, cawan porselin, oven, desikator, tanur pengabuan, labu Kjeldahl, kondensor, erlenmeyer, kapas, alat soxhlet, water bath shaker, kertas saring
whatman 42, evaporator vakum putar Buchi Rotavapor R-205, botol ekstrak,
freezer, tabung reaksi, pipet tetes, pipet volumetrik, kompor listrik, pipet mikro, inkubator, spektrofotometer UV-VIS Hitachi U-2800.
Bahan yang digunakan terdiri dari bahan utama dan bahan pembantu. Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah lintah laut (Discodoris
sp.) segar yang telah dikeringkan dengan panas matahari. Bahan pembantu yang digunakan antara lain air, aquades, H2SO4, selenium, NaOH 40 %, H3BO3, methyl
red, brom creosol green, HCl 0,1 %, pelarut lemak, asam klorida 2 N, metanol p.a, etanol p.a, aquabides, radikal bebas DPPH (1,1-difenil
-2-pikrilhidrazil), BHT (Butylated Hydroxytoluena) sebagai antioksidan pembanding, kloroform p.a, anhidrat asetat, asam sulfat pekat, pereaksi Dragendorff, pereaksi wagner, pereaksi Meyer, serbuk magnesium, HCl 37 %, etanol 70 %, FeCl3 5 %, pereaksi molisch, pereaksi benedict, pereaksi biuret, dan
larutan ninhidrin 0,1 %.
3.3. Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan melalui empat tahap, yaitu (1) pengambilan dan preparasi bahan baku, (2) karakterisasi bahan baku, (3) ekstraksi komponen antioksidan, dan (4) uji ekstrak kasar.
(32)
3.3.1. Pengambilan dan preparasi bahan baku
Bahan baku lintah laut (Discodoris sp.) diambil dari Perairan Tanjung Binga Kepulauan Belitung. Lintah laut ditemukan di pinggir pantai yang terdapat pasir dan karang-karang mati. Lintah laut diambil pada pagi hari sekitar pukul 9.00-11.00 wib saat air laut surut. Pengambilan lintah laut dilakukan saat air laut surut karena saat air pasang sangat sulit untuk menemukan keberadaan lintah laut. Ukuran panjang lintah laut yang digunakan berkisar 3-6 cm.
Daging lintah laut dipisahkan dari jeroannya kemudian dicuci dengan air bersih untuk menghilangkan benda-benda asing yang masih menempel seperti pasir, kerikil dan kotoran lainnya. Setelah bersih, daging lintah laut dikeringkan di bawah sinar matahari selama 2-3 hari. Lintah laut ditimbang berat utuhnya serta berat sebelum dan sesudah pengeringan untuk mengetahui rendemennya.
Lintah laut tanpa jeroan yang telah kering dihancurkan dengan menggunakan mortar dan blender sehingga diperoleh bentuk serbuk. Serbuk lintah laut tanpa jeroan inilah yang akan digunakan dalam analisis proksimat dan proses ekstraksi dengan pelarut polar.
3.3.2. Karakterisasi bahan baku
Karakterisasi lintah laut dilakukan melalui perhitungan rendemen dan uji proksimat.
3.3.2.1. Rendemen
Perhitungan rendemen digunakan untuk mengetahui persentase rendemen daging dan jeroan lintah laut baik segar ataupun kering. Adapun perumusan matematiknya adalah sebagai berikut:
3.3.2.2. Uji proksimat
Analisis proksimat dilakukan terhadap lintah laut yang telah dibuang jeroannya dan dikeringkan menggunakan sinar matahari, kemudian dihaluskan menggunakan mortar dan blender sehingga diperoleh sampel dalam bentuk serbuk. Analisis proksimat yang dilakukan adalah:
% 100 utuh laut lintah bobot
daging bobot (%)
(33)
1) Kadar air (AOAC 1995)
Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawa porselen dalam oven pada suhu 102-105 oC selama 30 menit. Cawan tersebut diletakkan dalam desikator (kurang lebih 30 menit) hingga dingin kemudian ditimbang hingga beratnya konstan, kemudian cawan dan daging lintah laut sebanyak 1-2 gram ditimbang setelah terlebih dahulu dihomogenkan. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 102-105 oC selama 6 jam. Cawan tersebut didinginkan dalam desikator dan kemudian ditimbang.
Kadar air ditentukan dengan rumus:
2) Kadar abu (AOAC 1995)
Cawan abu porselen dimasukkan dalam tungku pengabuan selama kurang lebih 1 jam. Setelah itu cawan abu porselen tersebut didinginkan dalam desikator dan ditimbang berat kosongnya. Daging lintah laut sebanyak 1-2 gram dimasukkan ke dalam cawan abu porselen, kemudian diletakkan dalam tungku pengabuan hingga suhu 600 oC. Proses pengabuan dilakukan sampai diperoleh abu berwarna abu-abu. Setelah itu cawan abu porselen didinginkan selama 30 menit dan ditimbang beratnya.
Kadar abu ditentukan dengan rumus:
3) Analisis abu tidak larut asam (FMC Corp. 1977)
Abu yang diperoleh dari penetapan kadar abu total dididihkan dengan 25 ml HCl 10 % selama lima menit. Bahan-bahan yang tidak terlarut disaring menggunakan kertas saring tak berabu, lalu didinginkan dalam desikator untuk selanjutnya ditimbang.
Kadar abu tidak larut asam ditentukan dengan rumus:
% 100 (g) sampel berat (g) abu berat (%) asam larut abu tidak
Kadar
% 100 (g) contoh berat (g) kering contoh berat -(g) contoh berat (%) air
Kadar
% 100 (g) sampel berat (g) abu berat (%) abu
(34)
4) Kadar protein (AOAC 1995)
Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi.
(1)Tahap destruksi
Daging lintah laut ditimbang sebanyak 0,1 gram, kemudian dimasukkan ke dalam tabung kjeltac. Selanjutnya ditambahkan selenium dan 3 ml H2SO4 ke dalam tabung tersebut. Tabung yang berisi larutan
tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410 oC. Proses destruksi dilakukan sampai larutan berwarna bening.
(2)Tahap destilasi
Isi labu dituangkan ke dalam labu destilasi, lalu ditambahkan dengan aquades 50 ml. Air bilasan juga dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan larutan NaOH 40 % sebanyak 20 ml.
Cairan dalam ujung tabung kondensor ditampung dalam erlenmeyer 125 ml berisi larutan H3BO3 dan 3 tetes indikator (cairan
methyl red dan brom creosol green) yang ada di bawah kondensor. Destilasi dilakukan sampai diperoleh 200 ml destilat yang bercampur dengan H3BO3 dan indikator dalam erlenmeyer.
(3)Tahap titrasi
Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan erlenmeyer berubah warna menjadi pink.
Kadar protein ditentukan dengan rumus:
5) Kadar lemak (AOAC 1995)
Penentuan kadar lemak dilakukan dengan menggunakan metode ekstraksi soxhlet. Daging lintah laut sebanyak 2 gram dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya dan disambungkan dengan
(ml HCl - ml HCl blanko) 0,1 N HCl 14,007
% N 100 %
mg sampel Kadar protein % N 6,25
(35)
tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet, lalau dipanaskan pada suhu 40 oC dengan menggunakan pemanas listrik selama 16 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105
o
C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan. Kadar lemak ditentukan dengan rumus:
3.3.3. Ekstraksi komponen antioksidan
Ekstraksi dilakukan untuk menghasilkan ekstrak kasar lintah laut dengan menggunakan pelarut. Komponen antioksidan pada lintah laut diperoleh melalui ekstraksi tunggal dengan menggunakan tiga pelarut polar yang berbeda, yaitu metanol, etanol dan aquabides.
Lintah laut tanpa jeroan kering yang telah dihancurkan ditimbang beratnya 50 gram, kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer. Masing-masing pelarut metanol dan etanol ditambahkan sampai sampel terendam dengan perbandingan bahan dan pelarut 1:3 (w/v). Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan aluminium foil untuk mencegah penguapan dari pelarut. Sampel dimaserasi menggunakan shaker
LED Orbitselama 5x24 jam. Setiap 24 jam, hasil maserasi disaring dengan kertas saring whatman 42 untuk memisahkan filtrat dengan ampasnya.
Ekstraksi dengan pelarut aquabides dilakukan dengan memanaskan aquabides sebanyak 750 ml dalam panci kaca hingga suhu 100 oC. Lintah laut tanpa jeroan kering yang telah dihancurkan ditambahkan ke dalam panci kaca sebanyak 50 gr sehingga diperoleh perbandingan bahan dan pelarut 1:15 (w/v). Sampel dan pelarut dipanaskan selama 20 menit dengan selalu diaduk. Setelah dingin, sampel disaring dengan menggunakan kain katun dilanjutkan dengan kertas saring whatman 42 untuk memisahkan filtrat dengan ampasnya.
Filtrat dari masing-masing pelarut dimasukkan dalam erlenmeyer dan disimpan dalam lemari es sampai waktunya evaporasi. Evaporasi filtrat hasil
% 100 (g) sampel berat
(g) lemak berat (%)
lemak
(36)
maserasi menggunakan pelarut etanol dan metanol dilakukan dengan evaporator vakum putar Buchi Rotavator R-205 pada suhu 37 oC, sedangkan filtrat aquabides dievaporasi pada suhu 54 oC sehingga diperoleh ekstrak kasar. Ekstrak kasar ini dimasukkan dalam botol ekstrak untuk dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (Blois 1958 diacu dalam Molyneux 2004) dan uji fitokimia secara kualitatif (Harborne 1987). Diagram alir proses ekstraksi komponen antioksidan menggunakan pelarut etanol, metanol, dan aquabides dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Diagram alir ekstraksi dengan pelarut etanol, metanol (Pramadhany 2006 yang dimodifikasi*), dan aquabides (Anesini et al. 2005 yang dimodifikasi*)
3.3.4. Ekstrak kasar
Analisis yang dilakukan terhadap ekstrak kasar menggunakan dua uji, yaitu uji aktivitas antioksidan (DPPH) untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari ekstrak masing-masing pelarut, dan uji fitokimia untuk mengetahui senyawa kimia yang terdapat dalam ekstrak lintah laut.
Lintah laut tanpa jeroan
Penimbangan (50 g)*
Maserasi 5x24 jam dengan etanol 150 ml (m/v)*
Penyaringan
Filtrat Residu
Evaporasi
Ekstrak kasar
Pemanasan selama 20 menit dalam pelarutaquabides 750 ml (m/v)* suhu 100 oC
Maserasi 5x24 jam dengan metanol 150 ml (m/v)*
(37)
3.3.4.1. Uji aktivitas antioksidan (DPPH) (Blois 1959 diacu dalam Molyneux 2004)
Ekstrak kasar lintah laut yang diperoleh dari proses ekstraksi dengan metanol p.a, etanol p.a, dan aquabides dilarutkan dalam metanol p.a dengan konsentrasi 100, 200, 500, 1000, 2000 dan 4000 ppm. Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dengan konsentrasi 5, 10, 25, 50, da 100 ppm. Larutan pereaksi DPPH yang digunakan dibuat dengan melarutkan DPPH dalam metanol p.a dengan konsentrasi 1 mM, yang dibuat segar dan dijaga pada suhu rendah serta terlindung dari cahaya. Sebanyak 4 ml larutan uji atau pembanding direaksikan dengan 1 ml larutan DPPH dalam tabung reaksi. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit, kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS Hitachi U-2800 pada panjang gelombang 517 nm. Larutan standar dibuat dengan mencampur 4 ml metanol p.a dengan 1 ml DPPH. Aktivitas antioksidan masing-masing sampel dan BHT dinyatakan dengan persentase penghambatan radikal bebas yang dihitung dengan rumus:
100
blanko absorbansi
sampel absorbansi
-blanko absorbansi
inhibisi
%
Nilai konsentrasi dan hambatan ekstrak diplot masing-masing pada sumbu x dan y. Persamaan garis yang diperoleh dalam bentuk y = bLn(x) + a digunakan untuk mencari nilai IC (inhibitor concentration), dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x sebagai IC50. Nilai IC50 menyatakan konsentrasi larutan
sampel yang dibutuhkan untuk mereduksi DPPH sebesar 50 %.
3.3.4.2. Uji fitokimia (Harborne 1987)
Uji fitokimia dilakukan untuk menentukan komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar lintah laut masing-masing pelarut. Uji fitokimia yang dilakukan terdiri dari uji alkaloid, steroid/triterpenoid, saponin, flavonoid, fenol hidrokuinon, molisch, benedict, biuret, ninhidrin. Metode uji didasarkan pada Harborne (1987).
a) Uji Alkaloid
Sebanyak 1 gr sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid, yaitu pereaksi Dragendorff, Meyer
(38)
dan Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, dengan pereaksi Wagner membentuk endapan putih kekuningan, dengan pereaksi Wagner membentuk endapan coklat dan dengan pereaksi Dragendorff membentuk endapan merah sampai jingga.
b) Uji Steroid/triterpenoid
Sebanyak 1 gr sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi. Anhidrida asetat sebanyak 10 tetes dan asam sulfat pekat sebanyak 3 tetes ditambahkan ke dalam campuran tersebut. Hasil uji positif sampel mengandung steroid dan triterpenoid yaitu terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau.
c) Uji Saponin (uji busa)
Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan sampel mengandung saponin.
d) Uji Flavonoid
Sebanyak 1 gr sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37 % dan etanol 95 % dengan volume sama) dan 4 ml alkohol, kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif sampel mengandung flavonoid yaitu terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol.
e) Uji Fenol hidrokuinon (pereaksi FeCl3)
Sebanyak 1 g sampel lintah laut kering diekstrak dengan 20 ml etanol 70 %. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5 %. Hasil uji positif sampel mengandung senyawa fenol
yaitu terbentukya larutan berwarna hijau atau hijau biru. f) Uji Molisch
Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambahkan 2 tetes pereaksi molisch dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Hasil uji positif sampel mengandung karbohidrat ditandai oleh terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan cairan.
(39)
g) Uji Benedict
Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Hasil uji positif sampel mengandung gula pereduksi yaitu terbentuknya larutan berwarna hijau, kuning atau endapan merah bata.
h) Uji Biuret
Larutan sampel sebanyak 1 ml ditambahkan pereaksi biuret sebanyak 4 ml. Campuran dikocok dengan seksama. Hasil uji positif sampel mengandung senyawa peptida yaitu terbentuknya larutan berwarna ungu.
i) Uji Ninhidrin
Larutan sampel sebanyak 2 ml ditambahkan beberapa tetes larutan ninhidrin 0,1 %. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil uji positif sampel mengandung asam amino yaitu terbentuknya larutan warna biru.
3.4. Analisis Data
Perlakuan pada penelitian ini adalah penggunaan jenis pelarut polar yaitu metanol, etanol, dan aquabides. Semua perlakuan dilakukan sebanyak dua kali ulangan. Rancangan percobaan yang digunakan untuk menganalisis data rendemen ekstrak dan hasil uji kandungan antioksidan dengan DPPH adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan model sebagai berikut (Steel dan Torie 1980):
Keterangan:
Yij = nilai pengamatan rendemen ekstrak; hasil uji kandungan antioksidan
(i) pada ulangan ke-j
ð = rataan umum
ái = pengaruh jenis pelarut polar (i)
åij = pengaruh galat jenis pelarut polar (i) pada ulangan ke-j
Hipotesis rancangan acak lengkap (RAL) terhadap rendemen ekstrak dan hasil uji kandungan antioksidan dengan DPPH adalah sebagai berikut:
H0 : jenis pelarut tidak berpengaruh nyata (ái = 0)
H1 : jenis pelarut berpengaruh nyata (ái ≠ 0)
(40)
Apabila hasil analisis ragam (ANOVA) pada rendemen ekstrak dan hasil uji kandungan antioksidan dengan DPPH berbeda nyata pada selang kepercayaan 95% (P<0,05), maka dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan dengan rumus sebagai berikut: S¢ = ඥሺሻȀ
Rp = qá’ x S¢
Keterangan:
S¢ = significant range = kuadrat tengah sisa
r = ulangan qá’ = significant studentized range
(41)
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Karakteristik Bahan Baku
Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini adalah lintah laut (Discodoris sp.) dari Perairan Tanjung Binga Kepulauan Belitung. Lokasi pengambilan lintah laut dapat dilihat pada Lampiran 1. Lintah laut dikurangi kadar airnya melalui proses pengeringan. Keuntungan dilakukannya pengeringan adalah daya awet bahan yang lebih lama, volume dan berat bahan menjadi lebih kecil sehingga mempermudah dan menghemat ruang pengangkutan. Pengeringan dapat berlangsung baik, jika pemanasan terjadi pada setiap tempat dari bahan dan uap air dikeluarkan dari seluruh permukaan bahan tersebut (Winarno et al. 1980).
Lintah laut tanpa jeroan kering memiliki tekstur yang keras, dan berwarna hitam kecoklatan. Setelah kering, lintah laut tanpa jeroan dihancurkan sehingga diperoleh bentuk serbuk. Bahan baku dalam bentuk serbuk dapat mempermudah saat analisis proksimat dan proses ekstraksi karena permukaan bahan baku yang kontak dengan pelarut lebih luas. Serbuk lintah laut tanpa jeroan disimpan dalam wadah tertutup untuk melindungi bahan baku dari lingkungan sekitarnya. Lintah laut segar, tanpa jeroan kering dan bentuk serbuknya dapat dilihat pada Gambar 4.
(42)
Karakterisasi dilakukan untuk mengetahui sifat dari bahan baku yang digunakan. Suatu bahan baku memiliki sifat fisik maupun kimia yang berbeda dengan yang lainnya. Karakterisasi pada penelitian ini meliputi pengukuran rendemen dan analisis kandungan gizi bahan baku (uji proksimat).
4.1.1. Rendemen
Rendemen adalah persentase bagian tubuh yang dapat dimanfaatkan. Lintah laut utuh ditimbang beratnya baik sebelum maupun sesudah diambil dengan jeroannya, kemudian dijemur dengan menggunakan panas matahari. Daging dan jeroan lintah laut yang telah kering ditimbang kembali untuk mengetahui penurunan berat setelah dikeringkan. Persen rendemen merupakan perbandingan antara berat daging segar/kering dengan berat utuh lintah laut yang digunakan.
Hasil pengukuran rendemen menunjukkan bahwa daging dan jeroan lintah laut segar memiliki rendemen sebesar 41,79 % dan 58,21 %, sedangkan rendemen daging dan jeroan lintah laut kering sebesar 7,20 % dan 8,64 %. Penurunan rendemen lintah laut disebabkan penguapan kandungan air dalam bahan dengan adanya energi panas matahari. Lintah laut yang berukuran besar akan memiliki rendemen yang besar pula. Nilai rendemen digunakan untuk mengetahui nilai ekonomis suatu produk atau bahan. Semakin tinggi rendemen maka semakin tinggi pula nilai ekonomisnya sehingga lebih efektif.
4.1.2. Kandungan gizi bahan baku
Senyawa kimia yang mutlak diperlukan oleh tubuh adalah zat gizi. Zat gizi berperan dalam penyediaan energi, proses pertumbuhan, perbaikan jaringan, pengaturan serta pemeliharaan proses fisiologis dan biokimiawi di dalam tubuh. Zat gizi diklasifikasikan dalam 6 kelompok besar yaitu karbohidrat, protein, lemak, vitamin, mineral dan air (Tejasari 2003).
Kandungan zat gizi pada lintah laut dapat diketahui melalui uji proksimat. Uji proksimat dilakukan untuk memperoleh data kasar tentang komposisi kimia suatu bahan. Nurjanah (2009) melakukan uji proksimat pada lintah laut utuh kering. Hasil uji menunjukkan bahwa lintah laut utuh kering mengandung abu tidak larut asam yang dapat merusak jaringan ginjal. Abu tidak larut asam tersebut berasal dari jeroannya yang tidak dibuang. Oleh karena itu, penelitian ini
(43)
melakukan uji proksimat pada lintah laut yang telah dibuang jeroannya. Zat gizi lintah laut tanpa jeroan kering yang diuji meliputi kadar air, kadar abu, kadar abu tidak larut asam, kadar protein, dan kadar lemak. Kadar karbohidrat diperoleh dengan perhitungan by difference. Hasil uji proksimat serbuk lintah laut tanpa jeroan kering dapat dilihat pada Tabel 3. Contoh perhitungan uji proksimat lintah laut tanpa jeroan kering dapat dilihat pada Lampiran 2.
Tabel 3. Hasil uji proksimat lintah laut tanpa jeroan kering
Komponen Nilai
Kadar air (%) 10,45
Kadar abu (%) 11,97
Kadar abu tidak larut asam (%) 0,20
Kadar lemak (%) 1,41
Kadar protein (%) 59,11
Kadar karbohidrat (%) 17,08
Kadar air sangat berpengaruh terhadap mutu bahan pangan karena keawetan suatu bahan pangan mempunyai hubungan yang erat dengan kadar air yang dikandungnya. Kandungan air dalam bahan makanan mempengaruhi daya tahan makanan terhadap serangan mikroba yang dinyatakan dengan aw, yaitu
jumlah air bebas yang dapat digunakan oleh mikroorganisme untuk pertumbuhannya (Winarno 1997). Hasil uji kadar air pada lintah laut tanpa jeroan kering adalah sebesar 10,45 %. Penelitian Nurjanah (2009) menunjukkan hasil uji kadar air pada lintah laut utuh kering sebesar 15,25 %. Kadar air yang lebih rendah pada penelitian ini diduga akibat pengaruh lingkungan saat penjemuran sehingga memperbesar penguapan kandungan air. Faktor-faktor yang mempengaruhi pengeringan terutama adalah luas permukaan bahan, suhu pengeringan, aliran udara, dan tekanan uap yang di udara (Winarno et al. 1980). Lintah laut tanpa jeroan kering memiliki kadar air yang lebih rendah dari lintah laut utuh kering sehingga dapat meningkatkan daya awet suatu bahan.
Abu adalah zat anorganik sisa hasil pembakaran suatu bahan organik. Kandungan abu dan komposisinya tergantung pada macam bahan dan cara pengabuannya. Kadar abu menunjukkan kandungan mineral yang terdapat dalam
(44)
suatu bahan (Sudarmadji et al. 2007). Mineral memegang peranan penting dalam memelihara fungsi tubuh, baik pada tingkat sel, jaringan, organ maupun fungsi tubuh secara keseluruhan (Almatsier 2006). Hasil uji kadar abu adalah sebesar 11,97 %, sedangkan hasil penelitian Nurjanah (2009) menunjukkan uji kadar abu lintah laut utuh kering sebesar 11,74 %. Hal ini menunjukkan bahwa lintah laut kering tanpa jeroan kering mengandung mineral yang tidak berbeda jauh dengan lintah laut utuh kering.
Abu tidak larut asam adalah garam-garam klorida yang tidak larut asam yang sebagian adalah garam-garam logam berat dan silika. Kadar abu tidak larut asam yang tinggi menunjukkan adanya kontaminasi residu mineral atau logam yang tidak dapat larut asam pada suatu produk (Basmal et al. 2003). Hasil uji kadar abu tidak larut asam adalah sebesar 0,20 %. Penelitian Nurjanah (2009) menunjukkan kadar abu tidak larut asam lintah laut utuh kering sebesar 1,9 %. Kadar abu tidak larut asam yang tinggi pada lintah laut utuh kering disebabkan jeroan yang tidak dibuang mengandung material-material abu yang tidak larut asam seperti pasir, lumpur, silika, dan batu. Kemungkinan ini bisa terjadi karena lintah laut termasuk anggota kelompok filum mollusca yang bersifat filter feeder
dan hidup menempel pada substrat. Lintah laut tanpa jeroan kering memiliki kadar abu tidak larut asam yang lebih rendah dari lintah laut utuh kering sehingga lebih aman untuk dikonsumsi.
Lemak merupakan bagian jaringan tubuh yang dapat digunakan untuk energi setelah dicerna. Menurut bobotnya, energi yang diperoleh dari lemak dua kali lebih banyak dibandingkan dengan karbohidrat dan protein (Helper et al. 1988). Kadar lemak yang didapatkan dari uji proksimat lintah laut tanpa jeroan adalah sebesar 1,41 %. Berdasarkan penelitian Nurjanah (2009), kandungan lemak pada lintah laut utuh adalah sebesar 4,58 %. Kadar lemak yang lebih rendah pada penelitian ini disebabkan telah dibuangnya jeroan lintah laut saat preparasi. Lemak pada tubuh umumnya disimpan sebesar 45 % di sekeliling organ dan rongga perut (Almatsier 2006).
Protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena selain berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur (Budiyanto 2002). Protein dibentuk oleh asam-asam
(45)
amino, yang mengandung unsur karbon (C), hidrogen (H), oksigen (O), (beberapa asam amino juga mengandung fosfor, besi, dan yodium) melalui ikatan peptida (Tejasari 2003). Hasil uji kadar protein pada lintah laut tanpa jeroan kering adalah sebesar 59,11 %. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Nurjanah (2009) diperoleh kadar protein lintah laut utuh kering sebesar 49,60 %. Hal ini disebabkan kandungan air yang lebih rendah pada lintah laut tanpa jeroan kering sehingga secara proporsional persentase kadar protein akan naik. Semakin meningkatnya kandungan air maka kandungan protein akan menurun dan sebaliknya (Syarief dan Halid 1993). Kadar protein yang lebih tinggi pada lintah laut tanpa jeroan kering menunjukkan potensi besar sebagai pangan fungsional kaya protein.
Karbohidrat adalah sumber kalori utama bagi kehidupan manusia dan hewan. Karbohidrat dalam ilmu gizi dibagi dalam dua golongan, yaitu karbohidrat sederhana (monosakarida, disakarida, gula alkohol, dan oligosakarida) dan karbohidrat kompleks (polisakarida dan serat) (Almatsier 2006). Hasil perhitungan by difference menunjukkan bahwa kadar karbohidrat lintah laut tanpa jeroan kering sebesar 17,08 %. Sedangkan penelitian Nurjanah (2009) menunjukkan kadar karbohidrat lintah laut utuh kering sebesar 18,83 %. Hal ini menunjukkan bahwa lintah laut utuh kering memiliki kandungan karbohidrat yang lebih tinggi dibandingkan dengan lintah laut tanpa jeroan kering.
4.2. Ekstraksi Komponen Antioksidan
Ekstraksi dilakukan untuk memisahkan komponen-komponen senyawa aktif dari suatu bahan dengan menggunakan pelarut. Metode ekstraksi yang digunakan pada penelitian ini adalah ekstraksi tunggal. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Prabowo (2009), metode ekstraksi tunggal menghasilkan rendemen dan aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan metode ekstraksi bertingkat. Selain itu, hasil ekstraksi juga dipengaruhi oleh jenis pelarut, waktu, dan suhu yang digunakan dalam proses ekstraksi (Row dan Jin 2005).
Penelitian ini menggunakan tiga pelarut polar untuk memperoleh komponen antioksidan melalui proses ekstraksi, yaitu etanol pro analyst (p.a), metanol pro analyst (p.a), dan aquabides. Pemilihan pelarut polar mengacu pada penelitian Nurjanah (2009) yang mengatakan bahwa rendemen ekstrak dan
(46)
aktivitas antioksidan lintah laut lebih banyak ditemukan pada ekstrak dengan pelarut polar sehingga diduga senyawa kimia yang terdapat di dalamnya bersifat polar. Penggunaan ketiga pelarut ini bertujuan untuk mengetahui rendemen dan sifat komponen bioaktif lintah laut pada pelarut polar dengan tingkat kepolaran yang berbeda.
Proses ekstraksi dengan pelarut polar menggunakan lintah laut dalam bentuk serbuk halus. Ukuran partikel yang kecil diharapkan dapat memperluas kontak sampel dengan pelarutnya sehingga semakin banyak komponen bioaktif yang dapat terekstrak. Selain itu, penghancuran akan memecah se-sel yang terdapat dalam jaringan sehingga komponen yang akan di ekstrak dapat cepat keluar dari bahan.
Perbandingan antara bahan dengan pelarut yang digunakan adalah sebesar 1:3 (w/v). Hal ini dilakukan untuk memperbanyak ekstrak kasar yang dihasilkan. Semakin besar volume pelarut maka jumlah bahan yang akan terekstrak akan semakin besar sampai larutan menjadi jenuh kemudian penambahan pelarut tidak akan menambah hasil ekstraksi (Hougton dan Raman 1998).
Proses maserasi dibantu dengan pengadukan dimaksudkan untuk memperbesar kemungkinan proses tumbukan antara bahan dengan pelarut sehingga senyawa bioaktif dapat terlarut dengan cepat ke dalam pelarut. Proses maserasi ini dilakukan selama 5x24 jam sampai filtrat berwarna lebih bening. Hal ini bertujuan untuk memperbanyak senyawa-senyawa kimia lintah laut yang terlarut dalam pelarut.
Aquabides dipilih sebagai pelarut karena bersifat murni dan terbebas dari kontaminasi serta garam-garam anorganik sehingga dapat memperkecil peluang ekstrak kasar terkontaminasi bahan lain. Ekstraksi dengan pelarut aquabides pada suhu tinggi (suhu 100 oC) dan dalam waktu singkat (20 menit) dilakukan untuk menghindari pembusukan pada hasil filtrat selama ektraksi karena bakteri cepat tumbuh dalam media air pada suhu ruang. Suhu tinggi dapat menginaktifkan bakteri yang tidak tahan panas, walaupun akan berpengaruh terhadap aktivitas antioksidan suatu bahan. Suatu bahan yang dipanaskan pada temperatur lebih dari 50 oC akan mengalami penurunan aktivitas antioksidan secara signifikan (Azizah et al. 1998).
(47)
Proses evaporasi dari filtrat lintah laut dengan ketiga pelarut polar menghasilkan ekstrak kasar dengan karakteristik yang berbeda-beda. Ekstrak kasar metanol dan etanol berwarna coklat pekat dalam bentuk pasta, sedangkan ekstrak kasar aquabides berwarna coklat kehijauan dalam bentuk pasta kering. Ekstrak kasar lintah laut dari ketiga pelarut dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Ekstrak kasar lintah laut
Hasil ekstraksi menggunakan tiga pelarut polar dengan tingkat kepolaran yang berbeda menunjukkan nilai yang berbeda-beda pula. Rendemen ekstrak merupakan perbandingan antara bobot ekstrak kasar yang dihasilkan dengan bobot awal yang digunakan. Nilai rendemen ekstrak dinyatakan dalam bentuk persen. Rendemen ekstrak kasar lintah laut dari ketiga pelarut dapat dilihat pada Gambar 6. Data rendemen ekstrak kasar lintah laut dapat dilihat pada Lampiran 3.
Gambar 6. Rendemen ekstrak kasar lintah laut 12,54
14,75
13,21
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Etanol Metanol Aquabides
R
e
n
d
e
m
e
n
(
%
)
(1)
c) Kadar lemak
% 100 (g) sampel berat
(g) lemak berat (%)
lemak
Kadar
% 100 g 2,0057
g 0,0274
1,37% d) Kadar protein
% 100 2,5
x sampel mg
14,007 x HCl N 0,1 x blanko) HCl
ml -blanko (ml N
%
% 100 2,5
x mg 152,7
14,007 x N 0,1 x ml) 0 -ml (23,35 N
%
9,42%
Kadar protein = % N x 6,25 = 9,42 % x 6,25 = 58,87 %
Lampiran 3. Data rendemen ekstrak kasar lintah laut
Jenis pelarut Ulangan Berat ekstrak (gram)
Rendemen (%)
Rata-rata (%)
Etanol 1 5,07 10,15 12,54
2 7,46 14,93
Metanol 1 6,57 13,13 14,75
2 8,18 16,37
Aquabides 1 6,28 13,85 13,21
2 6,92 12,57
Contoh perhitungan rendemen ekstrak kasar etanol ulangan 1: %
100 (g) awal sampel berat
(g) kasar ekstrak berat
(%)
(2)
% 100 g
50 g 5,0746
10,15%
Lampiran 4. Analisis sidik ragam rendemen ekstrak kasar lintah laut berdasarkan jenis pelarut
Sumber dB Jumlah Kuadrat Fhit P Keragaman Kuadrat Tengah
Jenis pelarut 2 5,136 2,568 0,44 0,680 Sisa 3 17,492 5,831
Total 5 22,629 Keterangan:
Bila P>0,05, maka gagal tolak H0, artinya jenis pelarut memberikan pengaruh yang tidak berbeda nyata
Lampiran 5. Contoh perhitungan konsentrasi uji aktivitas antioksidan a) DPPH
Stok DPPH 0,0010 M =
mol 1
g 394 ml 50 ml 1000
L 1 L
1 mol 0,0010
= 0,0197 g
DPPH sebanyak 0,0197 g dilarutkan dalam metanol p.a sampai 50 ml b) Standar BHT
Stok BHT 500 ppm = 25ml
ml 1000
L 1 L
1 mg 500
= 12,5 mg = 0,0125 g
Ekstrak sebanyak 0,0125 g dilarukan dalam metanol p.a sampai 25 ml BHT konsentrasi 100 ppm
V1xM1 = V2xM2
V1x500 ppm = 4 mlx100 ppm V1 = 0,8 ml
Metanol = 4 ml-0,8 ml = 3,2 ml = 3200 ìl
BHT sebanyak 0,8 ml ditambahkan metanol sebanyak 3200 ìl c) Sampel ekstrak
(3)
Stok ekstrak 5000 ppm = 25ml ml
1000 L 1 L
1 mg 5000
= 75 mg = 0,075 g
Ekstrak sebanyak 0,075 gram dilarutkan dalam metanol p.a sampai 25 ml Sampel ekstrak konsentrasi 1000 ppm
V1xM1 = V2xM2
V1x5000 ppm = 4 mlx1000 ppm V1 = 0,8 ml
Metanol = 4 ml-0,8 ml = 3,2 ml = 3200 ìl
Ekstrak sebanyak 0,8 ml ditambahkan metanol sebanyak 3200 ìl Lampiran 6. Contoh perhitungan persen penghambatan dan nilai IC50
a) Persen penghambatan (% inhibisi)
Pengukuran spektrofotometri UV-VIS menghasilkan nilai absorbansi untuk sampel ekstrak dan standar BHT. Nilai absorbansi masing-masing sampel dimasukkan ke dalam rumus:
100
blanko absorbansi
sampel absorbansi
-blanko absorbansi
inhibisi
%
Contoh: % inhibisi BHT 10 ppm
Absorbansi blanko: 1,836 Absorbansi BHT 10 ppm: 1,041
100
1,836 1,041 -1,836 inhibisi
% 43,30065 %
Konsentrasi BHT yang digunakan adalah 5, 10, 25, 50, 100 ppm masing-masing dicari % inhibisinya. Konsentrasi BHT diplot pada sumbu x dan inhibisi dari kelima konsentrasi tersebut diplot pada sumbu y sehingga diperoleh persamaan garis y = bx+a
b) perhitungan nilai IC50
Persamaan garis yang diperoleh dari regresi logaritmik BHT adalah y = 26,64ln(x)-14,39
y = 26,64ln(x)-14,39 ln(x) = 2,632179 x = 13,90404
(4)
Lampiran 7. Hasil uji aktivitas antioksidan
Sampel Konsentrasi
dalam ppm Absorbansi % inhibisi Persamaan garis IC50
Blanko 0 1,84
BHT 100 50 25 10 5 0,18 0,23 0,52 1,04 1,50 90,14 87,31 71,51 43,30 18,57
y = 24,80ln(x)-15,45 14,00
Sampel Konsentrasi
dalam ppm Absorbansi % inhibisi Persamaan garis IC50
Rataan IC50
Blanko 0 1,79
2152,93 Etanol 1 4000 2000 1000 500 200 100 0,47 1,08 1,37 1,61 1,71 1,77 73,67 39,72 23,42 9,64 4,20 1,01
y = 21,22ln(x)-108,7
2353,77 Etanol 2 4000 2000 1000 500 200 100 0,32 0,89 1,33 1,58 1,72 1,78 82,07 49,92 25,49 11,77 3,81 0,45
y = 18,30ln(x)-93,44
1770,10
Sampel Konsentrasi
dalam ppm Absorbansi % inhibisi Persamaan garis IC50
Rataan IC50
Blanko 0 1,79
1527,37 Metanol 1 4000 2000 1000 500 200 100 0,17 0,63 1,01 1,18 1,40 1,47 88,72 58,06 32,71 21,77 6,90 2,72
y = 21,60ln(x)-111,5
1266,24 Metanol 2 4000 2000 1000 500 200 0,31 0,93 1,34 1,53 1,70 82,80 47,68 24,71 14,45 4,71
y = 20,71ln(x)-105,1
(5)
100 1,76 1,29
Sampel Konsentrasi
dalam ppm Absorbansi % inhibisi Persamaan garis IC50
Rataan IC50
Blanko 0 1,79
3640,05 Aquabides
1
4000 2000 1000 500 200 100
0,60 1,08 1,44 1,62 1,70 1,79
66,50 39,55 19,38 9,24 5,04 -0,34
y = 16,94ln(x)-86,66
3188,47
Aquabides 2
4000 2000 1000 500 200 100
0,67 1,17 1,47 1,60 1,75 1,76
62,75 34,45 17,65 10,64 1,74 1,29
y = 15,64ln(x)-79,99
4091,63
Lampiran 8. Analisis sidik ragam aktivitas antioksidan ekstrak kasar lintah laut berdasarkan jenis pelarut
Sumber dB Jumlah Kuadrat Fhit P Keragaman Kuadrat Tengah
Jenis pelarut 2 4710833 2355416 8,44 0,059 Sisa 3 837351 279117
Total 5 5548184 Keterangan:
Bila P>0,05, maka gagal tolak H0, artinya jenis pelarut memberikan pengaruh yang tidak
berbeda nyata.
Lampiran 9. Gambar hasil uji fitokimia 1. Ekstrak kasar etanol lintah laut
(6)
2. Ekstrak kasar metanol lintah laut