Uji aktivitas antioksidan DPPH Blois 1959 diacu dalam Molyneux 2004 Uji fitokimia Harborne 1987

3.3.4.1. Uji aktivitas antioksidan DPPH Blois 1959 diacu dalam Molyneux 2004

Ekstrak kasar lintah laut yang diperoleh dari proses ekstraksi dengan metanol p.a, etanol p.a, dan aquabides dilarutkan dalam metanol p.a dengan konsentrasi 100, 200, 500, 1000, 2000 dan 4000 ppm. Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dengan konsentrasi 5, 10, 25, 50, da 100 ppm. Larutan pereaksi DPPH yang digunakan dibuat dengan melarutkan DPPH dalam metanol p.a dengan konsentrasi 1 mM, yang dibuat segar dan dijaga pada suhu rendah serta terlindung dari cahaya. Sebanyak 4 ml larutan uji atau pembanding direaksikan dengan 1 ml larutan DPPH dalam tabung reaksi. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit, kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS Hitachi U-2800 pada panjang gelombang 517 nm. Larutan standar dibuat dengan mencampur 4 ml metanol p.a dengan 1 ml DPPH. Aktivitas antioksidan masing-masing sampel dan BHT dinyatakan dengan persentase penghambatan radikal bebas yang dihitung dengan rumus: 100 blanko absorbansi sampel absorbansi - blanko absorbansi inhibisi   Nilai konsentrasi dan hambatan ekstrak diplot masing-masing pada sumbu x dan y. Persamaan garis yang diperoleh dalam bentuk y = bLnx + a digunakan untuk mencari nilai IC inhibitor concentration, dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x sebagai IC 50 . Nilai IC 50 menyatakan konsentrasi larutan sampel yang dibutuhkan untuk mereduksi DPPH sebesar 50 .

3.3.4.2. Uji fitokimia Harborne 1987

Uji fitokimia dilakukan untuk menentukan komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar lintah laut masing-masing pelarut. Uji fitokimia yang dilakukan terdiri dari uji alkaloid, steroidtriterpenoid, saponin, flavonoid, fenol hidrokuinon, molisch, benedict, biuret, ninhidrin. Metode uji didasarkan pada Harborne 1987. a Uji Alkaloid Sebanyak 1 gr sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid, yaitu pereaksi Dragendorff, Meyer dan Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, dengan pereaksi Wagner membentuk endapan putih kekuningan, dengan pereaksi Wagner membentuk endapan coklat dan dengan pereaksi Dragendorff membentuk endapan merah sampai jingga. b Uji Steroidtriterpenoid Sebanyak 1 gr sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi. Anhidrida asetat sebanyak 10 tetes dan asam sulfat pekat sebanyak 3 tetes ditambahkan ke dalam campuran tersebut. Hasil uji positif sampel mengandung steroid dan triterpenoid yaitu terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau. c Uji Saponin uji busa Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan sampel mengandung saponin. d Uji Flavonoid Sebanyak 1 gr sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol campuran asam klorida 37 dan etanol 95 dengan volume sama dan 4 ml alkohol, kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif sampel mengandung flavonoid yaitu terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol. e Uji Fenol hidrokuinon pereaksi FeCl 3 Sebanyak 1 g sampel lintah laut kering diekstrak dengan 20 ml etanol 70 . Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl 3 5 . Hasil uji positif sampel mengandung senyawa fenol yaitu terbentukya larutan berwarna hijau atau hijau biru. f Uji Molisch Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambahkan 2 tetes pereaksi molisch dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Hasil uji positif sampel mengandung karbohidrat ditandai oleh terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan cairan. g Uji Benedict Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Hasil uji positif sampel mengandung gula pereduksi yaitu terbentuknya larutan berwarna hijau, kuning atau endapan merah bata. h Uji Biuret Larutan sampel sebanyak 1 ml ditambahkan pereaksi biuret sebanyak 4 ml. Campuran dikocok dengan seksama. Hasil uji positif sampel mengandung senyawa peptida yaitu terbentuknya larutan berwarna ungu. i Uji Ninhidrin Larutan sampel sebanyak 2 ml ditambahkan beberapa tetes larutan ninhidrin 0,1 . Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil uji positif sampel mengandung asam amino yaitu terbentuknya larutan warna biru.

3.4. Analisis Data

Perlakuan pada penelitian ini adalah penggunaan jenis pelarut polar yaitu metanol, etanol, dan aquabides. Semua perlakuan dilakukan sebanyak dua kali ulangan. Rancangan percobaan yang digunakan untuk menganalisis data rendemen ekstrak dan hasil uji kandungan antioksidan dengan DPPH adalah rancangan acak lengkap RAL dengan model sebagai berikut Steel dan Torie 1980: Keterangan: Y ij = nilai pengamatan rendemen ekstrak; hasil uji kandungan antioksidan i pada ulangan ke-j ð = rataan umum á i = pengaruh jenis pelarut polar i å ij = pengaruh galat jenis pelarut polar i pada ulangan ke-j Hipotesis rancangan acak lengkap RAL terhadap rendemen ekstrak dan hasil uji kandungan antioksidan dengan DPPH adalah sebagai berikut: H : jenis pelarut tidak berpengaruh nyata á i = 0 H 1 : jenis pelarut berpengaruh nyata á i ≠ Y ij = ð + á i + å ij