11
II. METODOLOGI
3.1 BAHAN DAN ALAT
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah SCFA butirat yang dihasilkan dari fermentasi pati resisten tipe 3 dengan bakteri fermentatif Clostridium butyricum BCC B2571 yang
berasal dari Balai Besar Veteriner Bogor. Pati resisten yang digunakan merupakan pati ubi jalar varietas Jago yang diperoleh dari Balai Penelitian Ubi-ubian dan Serealia Baliser Malang. Sampel
yang digunakan berupa cell free supernatant yang memiliki rasio molar asam asetat, propionat, dan butirat 52.95 mM : 66.93 mM : 92.41 mM atau 1 : 1.3 : 1.7. SCFA butirat ini kemudian diperlakukan
pada sel VERO ATCC CCL-81 dan sel HCT-116 ATCC CCL-247 yang didapat dari Pusat Studi Satwa Primata Bogor. Sel VERO merupakan sel lestari non kanker yang diisolasi dari organ ginjal
monyet hijau afrika dewasa sedangkan sel HCT 116 merupakan sel kanker kolon yang diisolasi dari jaringan kolon manusia.
Bahan yang digunakan adalah media Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM Gipco USA yang disuplementasikan dengan Fetal Bovine Serum 10 Gipco USA dan antibiotik
penisilin 100 unitmL; streptomycin 100μgmL Invitrogen USA, Phosphate Buffer Saline PBS 1X steril Gipco USA, Trypsin 0.25, Glutaraldehyde 2, serta pewarna Hoescht 33258 10 mgL
Sigma USA. Sedangkan alat yang digunakan adalah flask T25, hemasitometer, mikroskop inversi, mikroskop fluorosencence, biosafety cabinet, refrigerator, mikro pipet, pipet steril, sentrifuse 1500 G,
tabung sentrifuse, water-bath, spectrophotometry double beam, microplate 24 well.
3.2 METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian ini dibagi menjadi tiga tahap, yaitu : tahap penyiapan sel dan pengkulturan sub kultur, tahap analisa toksisitas dengan metode hemasitometer, dan tahap deteksi apoptosis dengan
pewarnaan Hoescht 33258.
3.2.1 Penyiapan Sel dan Pengkulturan Sub Kultur Purwani, 2011
Sel yang digunakan untuk analisis ini merupakan sel yang dibekukan dalam freezer bersuhu -70°C sehingga harus dilakukan pencairan thawing dalam water-bath bersuhu
37°C. Sel tersebut kemudian ditanam ke dalam flask T25 dengan diisikan media Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM yang telah disuplementasikan dengan serum Fetal Bovine
Serum 10 dan antibiotik penisilin 100 unitmL ; streptomycin 100 μgmL. Setelah ditanam
dalam flask T25, sel kemudian diinkubasikan dalam inkubator bersuhu 37°C dan 5 CO
2
. Sub kultur sel dilakukan setiap seminggu sekali dengan bergantung pada jumlah
konfluensi sel yang telah mencapai 100. Selain itu, untuk menjaga kebutuhan nutrisi sel yang cukup maka media diganti setiap 2-3 hari. Proses subkultur sel dilakukan dengan
membuang media sel dalam flask yang kemudian ditambahkan dengan Phosphate Buffered Saline PBS 1X sebanyak 5 ml untuk mencuci media yang masih tertinggal dalam flask T25.
Setelah PBS dibuang, trypsin 0.25 sebanyak 5 ml ditambahkan ke dalam flask untuk melepaskan sel yang menempel pada dinding-dinding flask kemudian diinkubasikan pada
12
suhu 37°C dan 5 CO
2
selama 5-10 menit. Media sebanyak 3 ml kemudian ditambahkan pada flask T25 berisi trypsin 0.25 dan dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse. Suspensi
sel kemudian disentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit. Setelah mendapatkan pellet dan supernatan, media kemudian dibuang untuk membuang sekaligus menghentikan
kerja trypsin hingga yang tersisa hanya pellet. Pellet kemudian diresuspensikan dengan media segar DMEM sebanyak 3 ml dan dihitung dengan hemasitometer untuk mengetahui
jumlah sel yang akan ditanam secara akurat. Setiap sub kultur, sel yang ditanam sebanyak 1x10
5
sel ke dalam flask T25.
3.2.2 Analisa Toksisitas Purwani. 2011
Analisa toksisitas dengan metode hemasitometer dilakukan pada sel VERO dan sel HCT-116. Analisis ini dilakukan untuk mencari konsentrasi yang tepat dari SCFA butirat
yang memiliki toksisitas kurang dari 50 terhadap sel VERO serta konsentrasi SCFA butirat yang memiliki daya toksisitas lebih dari 50 terhadap sel HCT-116. Tahap awal yang
dilakukan adalah penanaman sel pada microplate 24 well dengan jumlah 1x10
4
sel dan disuplementasi dengan 1 ml media tumbuh untuk setiap well. Tahap selanjutnya adalah
pengenceran SCFA dari konsentrasi awal ke beberapa konsentrasi yaitu 10 mM; 5 mM; 2.5 mM; 1.25 mM; dan 0.625 mM untuk sel VERO dan konsentrasi 1.25 mM; 0.625 mM; 0.313
mM; 0.156 mM; dan 0.078 mM untuk sel HCT-116. Pada tiap konsentrasi pengenceran SCFA butirat dengan media DMEM dipersiapkan sebanyak 2 mL. Media sel dalam
microplate 24 well kemudian diganti dengan media yang telah diencerkan dengan konsentrasi SCFA yang telah dibuat. Setiap konsentrasi yang dibuat dilakukan duplo. Sel dalam media
yang mengandung konsentrasi SCFA hasil pengenceran tersebut kemudian diinkubasikan kembali pada suhu 37°C dan CO
2
5 selama 48 jam. Setelah 48 jam, sel kemudian dihitung menggunakan me
tode hemasitometer sebanyak 50 μL menggunakan tryphan blue 0.1, pengamatan dilakukan dengan menggunakan mikroskop inversi. Pada perhitungan, jumlah
selmL dapat dihitung dengan rumus :
Persen inhibisi dapat dihitung dengan rumus Purwani, 2011:
Keterangan: A = Jumlah sel hidup pada kontrol
B = Jumlah sel hidup pada perlakuan dengan SCFA pada konsentrasi tertentu
13
3.2.3 Deteksi Apoptosis menggunakan pewarnaan Hoechst
Kategori