Tempat dan Waktu Penelitian Alat-Alat Identifikasi Sampel Identifikasi Sampel Analisis Kualitatif

18

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Farmasi Kualitatif dan Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara Medan pada bulan November 2014 - Februari 2015. 3.2 Bahan-Bahan 3.2.1 Sampel Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tempuyung segar yang diperoleh secara purposif di lingkungan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara dan sediaan kapsul ekstrak daun tempuyung yang diproduksi oleh UD Rachma Sari yang tersedia di pasaran.

3.2.2 Pereaksi

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini berkualitas pro analisis keluaran E. Merck yaitu natrium karbonat, asam pikrat, asam nitrat 65, asam, asam sulfat 96, etanol 96, ammonium oksalat, kalsium klorida, kalsium karbonat, akua demineralisata, larutan baku kalium 1000 µgmL dan larutan baku kalsium 1000 µgmL.

3.3 Alat-Alat

Alat-alat yang digunakan adalah spatula, neraca analitik, gelas ukur, beaker glass, erlemeyer, pipet tetes, corong, penyaring, kertas saring biasa, kertas saring whatmann no.42, batang pengaduk, panci infusa, hot plate, labu ukur, kertas label, inkubator, dan seperangkat alat Spektofotometer Serapan Atom. Universitas Sumatera Utara 19

3.4 Identifikasi Sampel

Identifikasi sampel dilakukan oleh bagian Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi - LIPI Bogor. 3.5 Pembuatan Pereaksi 3.5.1 Larutan H 2 SO 4 1 N Sebanyak 3 mL larutan asam sulfat 96 diencerkan dengan akuabides hingga 100 mL Ditjen POM, 1979.

3.5.2 Larutan Asam Pikrat 1

Sebanyak 1 gram asam pikrat dilarutkan dalam akuabides hingga 100 mL Ditjen POM, 1979.

3.5.3 Larutan amonium oksalat

Sebanyak 3,5 gram ammonium oksalat dilarutkan dalam akuabides hingga 100 mL Ditjen POM, 1995.

3.5.4 Larutan kalsium klorida

Sebanyak 7,5 gram kalsium klorida dilarutkan dalam akuabides hingga 100 mL Ditjen POM, 1995.

3.5.5 Bahan untuk pembuatan kalsium oksalat

Kalsium Oksalat diperoleh dengan cara mereaksikan larutan kalsium klorida dengan larutan ammonium oksalat Vogel, 1979. 3.6 Prosedur Penelitian 3.6.1 Pengambilan Sampel Metode pengambilan sampel dilakukan dengan cara sampling purposive yang dikenal juga sebagai sampling pertimbangan dimana sampel ditentukan atas Universitas Sumatera Utara 20 dasar pertimbangan bahwa sampel yang diambil dapat mewakili populasi Sudjana, 2005. 3.6.2 Penyiapan Sampel 3.6.2.1 Pembuatan infusa Daun tempuyung dibersihkan dari pengotornya kemudian dicuci bersih dengan air mengalir dan ditiriskan sampai air cuciannya kering. Setelah itu infusa dibuat menurut prosedur Farmakope Indonesia Edisi IV yaitu ditimbang 50 gram daun tempuyung ke dalam panci infusa, dicukupkan dengan akua demineralisata hingga 500 ml, dipanaskan pada suhu 90°C selama 15 menit sambil sekali-sekali diaduk, serkai selagi panas melalui kain flanel, ditambahkan akua demineralisata secukupnya melalui ampas hingga diperoleh volume infusa 500 ml Ditjen POM, 1995. Penyiapan infusa untuk analisis kalsium awal Diambil 100 ml dari larutan infusa menggunakan labu tentukur, dimasukkan ke erlenmeyer 250 ml, untuk analisis kalsium awal pada infusa, tanpa inkubasi dengan kalsium oksalat maupun kalsium karbonat. Inkubasi infusa dengan kalsium oksalat Diambil 200 ml dari larutan infusa lalu dipindahkan ke beaker glass 250 ml, dimasukkan500 mg kalsium oksalat dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 4 jam, diaduk setiap 10 menit. Inkubasi infusa dengan kalsium karbonat Dengan cara yang sama dilakukan seperti inkubasi infusa dengan kalsium oksalat,tetapi yang ditambahkan adalah 500 mg kalsium karbonat. Universitas Sumatera Utara 21

3.6.2.2 Pembuatan larutan serbuk kapsul

Diambil dua kapsul tempuyung, dibuka cangkangnya, dimasukkan semua serbuknya dalam labu tentukur 500 ml, ditambahkan akua demineralisata hingga garis tanda, hal ini sesuai dengan cara pemakaian yang tertera pada kemasan. Penyiapan larutan serbuk kapsul untuk analisis kalsium awal Diambil 100 ml dari larutan serbuk kapsul menggunakan labu tentukur, dimasukkan ke erlenmeyer 250 ml,untuk analisis kalsium awal pada larutan serbuk kapsul, tanpa inkubasi dengan kalsium oksalat maupun kalsium karbonat. Inkubasi larutan serbuk kapsul dengan kalsium oksalat Diambil 200 ml dari larutan infusa lalu dipindahkan ke beaker glass 250 ml, lalu ditambahkan dengan 500mg kalsium oksalat dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 4 jam, diaduk setiap 10 menit. Inkubasi larutan serbuk kapsul dengan kalsium karbonat Dengan cara yang sama dilakukan seperti inkubasi larutan serbuk kapsul dengan kalsium oksalat, tetapi yang ditambahkan adalah 500 mg kalsium karbonat.

3.6.3 Pembuatan Larutan Uji I

Larutan uji ini terdiri dari enam larutan, yaitu dua larutan tanpa inkubasi, dua larutan setelah diinkubasi dengan kalsium oksalat, dua larutan setelah diinkubasi dengan kalsium karbonat.Enam larutan ini disaring dengan kertas saring whatmann no.42.Masing-masing hasil saringan diambil sebanyak 100 ml menggunakan labu tentukur, dimasukkan dalam erlenmeyer 250 ml, ditambahkan 10 ml asam nitrat 65 vv,didiamkan selama 24 jam, dan kemudian dipanaskan di atas hot plate sampai jernih. Universitas Sumatera Utara 22

3.6.4 Pembuatan Larutan Uji II

Sampel hasil larutan uji I dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 mL, erlemeyer dibilas tiga kali dengan akua demineralisata, dimasukkan ke dalam labu tentukur,, kemudian dicukupkan dengan akua demineralisata sampai garis tanda.Disaring dengan kertas saring Whatmann No.42 dan ±10 mL larutan pertama dibuang untuk menjenuhkan kertas saring. Kemudian larutan selanjutnya ditampung ke dalam botol. Larutan ini digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif terhadap logam kalsium dan kalium di dalamnya. 3.6.5 Analisis Kualitatif 3.6.5.1 Kalsium Uji kristal kalsium dengan asam sulfat 1N Larutan sampel hasil destruksi sebanyak 1 - 2 tetes diteteskan pada object glass kemudian ditetesi dengan larutan asam sulfat 1N dan etanol 96 akan terbentuk endapan putih lalu diamati di bawah mikroskop. Jika terdapat kalsium akan terlihat kristal berbentuk jarum Vogel, 1979. 3.6.5.2 Kalium Reaksi kualitatif dengan uji nyala Kawat NiCr dicelupkan kedalam sampel lalu dipijarkan pada api bunsen, diamati warna yang terjadi pada nyala bunsen. Jika terdapat kalium, akan terbentuk warna ungu pada nyala bunsen Vogel, 1979. Uji kristal kalium dengan asam pikrat Larutan zat diteteskan 1 - 2 tetes pada object glass kemudian ditetesi dengan larutan asam pikrat, dibiarkan ± 5 menit lalu diamati dibawah mikroskop. Jika terdapat kalium, akan terlihat kristal berbentuk jarum-jarum besar. Universitas Sumatera Utara 23 3.6.6 Analisis Kuantitatif 3.6.6.1 Pembuatan kurva kalibrasi Pembuatan kurva kalibrasi kalsium Larutan baku kalsium 1000 µ gmL sebanyak 5 mL dimasukkan kedalam labu tentukur 50 mL lalu diencerkan dengan akua demineralisata hingga garis tanda. Dari larutan tersebut 100 µgmL dipipet masing-masing 1,0 mL; 2,0 mL; 3,0 mL; 4,0 mL; dan 5,0 mL dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL dan diencerkan dengan akua demineralisata hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 2 µ gmL; 4 µgmL; 6 µ gmL; 8 µ gmL; dan 10 µ gmL, lalu dilakukan pengukuran pada panjang gelombang 422,7 nm dengan tipe nyala udara-asetilen. Pembuatan kurva kalibrasi kalium Larutan baku kalium 1000 µgmL sebanyak 5 mL dimasukkan kedalam labu tentukur 50 mL lalu diencerkan dengan akua demineralisata hingga garis tanda. Dari larutan tersebut 100 µgmL dipipet masing-masing 1,0 mL; 2,0 mL; 3,0 mL; 4,0 mL; dan 5,0 mL dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL dan diencerkan dengan akua demineralisata hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 2,0 µgmL; 4,0 µ gmL; 6,0 µ gmL; 8,0 µgmL; dan 10,0 µgmL, lalu dilakukan pengukuran pada panjang gelombang 766,5 nm dengan tipe nyala udara-asetilen.

3.6.6.2 Analisis kadar mineral pada sampel Analisis kadar kalsium awal pada sampel

Larutan uji yang digunakan untuk analisis kadar kalsium awal adalah infusa dan larutan serbuk kapsul tanpa inkubasi dengan kalsium oksalatkarbonat Universitas Sumatera Utara 24 infusa dipipet sebanyak 0,1 mL dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL Faktor pengenceran = 100,1 = 100 kali, sedangkan untuk larutan serbuk kapsul dipipet 0,2 mL dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 mLFaktor pengenceran = 250,2 = 125 kali, masing-masing diencerkan dengan akua demineralisata hingga garis tanda. Larutan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer serapan atom pada panjang gelombang 422,7 nm dengan tipe nyala udara-asetilen. Nilai absorbansi yang diperoleh harus berada dalam rentang kurva kalibrasi larutan baku kalsium. Konsentrasi kalsium dalam sampel dihitung berdasarkan persamaan garis regresi dari kurva kalibrasi. Analisis kadar kalium pada larutan sampel Dilakukan cara yang sama dengan analisis kadar kalsium awal, namun diukur pada panjang gelombang 766,5 nm. Analisis kadar kalsium pada larutan sampel setelah inkubasi dengan kalsium oksalat Larutan uji yang digunakan untuk analisis kadar kalsium awal adalah infusa dan larutan serbuk kapsul setelah inkubasi dengan kalsium oksalat. Dilakukan analisis kadar kalsium setelah inkubasi dengan kalsium oksalat dengan cara yang sama dengan analisis kadar kalsium awal. Analisis kadar kalsium pada larutan sampel setelah inkubasi dengan kalsium karbonat Larutan uji yang digunakan untuk analisis kadar kalsium awal adalah infusa dan larutan serbuk kapsul setelah inkubasi dengan kalsium karbonat. Dilakukan analisis kadar kalsium setelah inkubasi dengan kalsium karbonat dengan cara yang sama dengan analisis kadar kalsium awal. Universitas Sumatera Utara 25 Perhitungan kadar kalsium dan kalium pada sampel Menurut Gandjar dan Rohman 2008, penentuan kadar dengan persamaan regresi y=ax+b dalam sampel dapat dihitung dengan cara: mL Vs Fp x mL V x µgmL X µgmL Logam Kadar  X = konsentrasi analit dalam larutan sampel V= volume total larutan sampel yang diperiksa Fp= Faktor pengenceran dari hasil dekstruksi Vs= Volume sampel 3.6.7 Analisis Data Secara Statistik 3.6.7.1 Penolakan hasil pengamatan Menurut Sudjana 2005, kadar kalsium dan kalium yang diperoleh dari hasil pengukuran masing-masing larutan sampel dianalisis dengan metode standar deviasi dengan rumus: SD =   1 - n X - Xi 2  Keterangan: Xi = Kadar sampel X = Kadar rata-rata sampel n = Jumlah perlakuan Untuk mencari t hitung digunakan rumus: t hitung = n SD X Xi  apabila t hitung t tabel , maka data ditolak . Universitas Sumatera Utara 26 Sedangkan untuk menentukan kadar mineral di dalam sampel dengan interval kepercayaan 99, α = 0.01, dk = n-1, dapat digunakan rumus: Kadar Mineral: µ = ± tα2, dk x SD √n Keterangan: = Kadar rata-rata sampel SD = Standar Deviasi dk = Derajat kebebasan dk = n-1 α = Interval kepercayaan n = Jumlah perlakuan

3.6.7.2 Analisis kelarutan kalsium oksalat dan kalsium karbonat pada sampel setelah inkubasi

Pengujian beda nilai rata-rata antar sampel Untuk mengetahui perbedaan nilai rata-rata kadar kalsium sampel awal, setelah inkubasi dengan kalsium oksalat, dan setelah inkubasi dengan kalsium karbonat dilakukan analisis statistic dengan uji one way ANOVA dengan Statistical Product Services Solution SPSS dengan taraf kepercayaan 99. Dengan menggunakan uji Tukey. Teknik ini merupakan teknik analisi yang fungsinya untuk menguji perbedaan lebih dari dua sampel. Kadar kalsium terlarut dan persen kelarutan kalsium oksalatkalsium karbonat Data yang diperoleh dari pengukuran dengan spektrofotometer serapan atom dinyatakan kadar kalsium terlarut dalam gmL dan persen kelarutan kalsium oksalatkalsium karbonat dalam persen . Universitas Sumatera Utara 27 Kadar kalsium terlarut merupakan kenaikan kadar kalsium setelah diinkubasi dengan kalsium oksalat atau kalsium karbonat atau kadar kalsium setelah inkubasi dikurangi dengan kadar kalsium awal larutan sampel. Kada r Ca terlarut gmL = Kenaikan Kadar Ca =Kadar Ca terlarut setelah inkubasi – Kadar Ca awal Persen kelarutan kalsium oksalat atau kalsium karbonat adalah kadar kalsium terlarut dibagi kadar kalsium awal dikalikan 100 Persen kelarutan = 100 awal Ca Kadar terlarut Ca Kadar x

3.6.8 Penentuan Batas Deteksi Dan Batas Kuantitasi

Batas deteksi merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan. Sedangkan batas kuantitasi merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Menurut Harmita 2004, batas deteksi dan batas kuantitasi ini dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: Simpangan Baku X SY =   2 2    n Yi Y Batas deteksi LOD = slope X SY x 3 Batas kuantitasi LOQ = slope X SY x 10 Universitas Sumatera Utara 28

3.6.9 Uji Perolehan Kembali Recovery

Menurut Harmita 2004, uji perolehan kembali atau recovery dapat dilakukan dengan metode penambahan larutan standar standard addition method. Dalam metode ini, kadar mineral dalam sampel ditentukan terlebih dahulu, selanjutnya dilakukan penentuan kadar mineral dalam sampel setelah penambahan larutan standar dengan konsentrasi tertentu Ermer dan Miller, 2005.Larutan baku ditambahkan pada sampel yaitu 1 mL larutan baku kalsium konsentrasi 1000 µgmL, 4 mL larutan baku kalium konsentrasi 1000 µgmL. Kemudian dilanjutkan dengan prosedur destruksi basah seperti yang telah dilakukan sebelumnya. Menurut Harmita 2004, persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus: Perolehan Kembali = C F - C A CA x 100 Keterangan: C A = Kadar logam dalam sampel sebelum penambahan baku C F = Kadar logam dalam sampel setelah penambahan baku C A = Kadar larutan baku yang ditambahkan

3.6.10 Simpangan Baku Relatif

Menurut Harmita 2004, keseksamaan atau presisi diukur sebagai simpangan baku relatif atau koefisien variasi. Keseksamaan atau presisi merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual ketika suatu metode dilakukan secara berulang untuk sampel yang homogen. Nilai simpangan baku relatif yang memenuhi persyaratan menunjukkan Universitas Sumatera Utara 29 adanya keseksamaan metode yang dilakukan. Adapun rumus untuk menghitung simpangan baku relatif adalah: RSD = 100  X SD Keterangan: = Kadar rata-rata sampel SD = Standar Deviasi RSD = Relative Standard Deviation Universitas Sumatera Utara 30

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Identifikasi Sampel

Hasil identifikasi sampel yang dilakukan oleh bagian Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI-Bogor terhadap Daun Tempuyung adalah jenis Sonchus arvensis L. suku Compositae. Hasil identifikasi sampel dapat dilihat pada Lampiran 20 halaman 87.

4.2 Analisis Kualitatif

Analisis kualitatif dilakukan sebagai analisis pendahuluan untuk mengetahui ada atau tidaknya mineral kalium dan kalsium dalam sampel. Data dapat dilihat pada Tabel 4.1 dan Lampiran 3 halaman 45. Tabel 4.1 Hasil Analisis Kualitatif pada Sampel Infusa Daun Tempuyung Segar dan Larutan Kapsul Ekstrak Tempuyung yang Telah Didestruksi No. Mineral Pereaksi Hasil Reaksi Hasil 1. 2. Ca K Asam sulfat 1 N Uji Nyala Asam pikrat 1 Kristal jarum Menghasilkan nyala ungu Kristal jarum kasar + + + Keterangan: + = Mengandung mineral Tabel 4.1 menunjukkan bahwa larutan sampel yang diperiksa mengandung mineral kalsium dan kalium. Sampel positif mengandung mineral kalium dengan penambahan asam pikrat 1 menghasilkan kristal jarum kasar, positif mengandung mineral kalsium karena menghasilkan endapan putih CaSO 4 berbentuk kristal jarum dengan penambahan asam sulfat 1N juga menghasilkan kalium pikrat serta menghasilkan nyala ungu dengan uji nyala dengan kawat Universitas Sumatera Utara 31 NiCr. Berdasarkan hasil reaksi pengendapan maupun reaksi kristal dari masing- masing kedua mineral tersebut membuktikan larutan sampel mengandung mineral kalsium dan kalium. 4.3 Analisis Kuantitatif 4.3.1 Kurva Kalibrasi Kalisum Dan Kalium