Analisis profil kimia fraksi torbangun Analisa HPLC

23 Bahan Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel tanaman Torbangun yang diperoleh dari Kebun Percobaan IPB, Leuwikopo, Dramaga Bogor. Bahan untuk proses ekstraksi antara lain: pelarut etanol 97, n-heksana, kloforom, etil asetat, aquades dan kertas saring. Sel yang digunakan adalah sel adenokarsinoma payudara galur MCF-7 yang disediakan oleh Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Pusat Studi Satwa Primata, IPB. Reagen-reagen dan bahan untuk kultur sel seperti media RPMI 1640, FBS, penicillinstreptomycin, DMSO, Dulbecco’s PBS, trypsin, dan trypane blue. Peralatan penelitan Peralatan untuk proses ekstraksi dan uji kimia yaitu freeze drier, sonikator, sentrifus, rotary evaporator, platform shaker, refrigerator, freezer, blender, timbangan analitik, alat-alat gelas, vortex, vacuum filter, desikator, dan tabung sampel. Peralatan untuk kultur sel dan uji sitotoksisitas yaitu: incubator CO 2 , Biosafety cabinet Class 2, microscope fluorescence, hemocytometer, high speed centrifuge, dan microplate reader. Tahap persiapan sampel Sampel daun torbangun Plectranthus amboinicus Lour. Spreng diekstrak dan difraksinasi sebagaimana prosedur yang telah dijelaskan pada Bab 3 terdahulu. Terdapat 5 fraksi yang akan diuji yakni ekstrak etanol, fraksi heksana, fraksi kloroform, fraksi etil asetat dan fraksi air. Uji Fitokimia Semua ekstrak dan fraksi diuji keberadaan komponen fitokimianya secara kuantitatif. Parameter uji fitokimia antara lain alkaloid, fenolik yang terdiri atas flavonoid, tanin dan saponin, kemudian triterpenoid dan steroid serta hidrokuinon. Prosedur uji fitokimia tersaji dalam Lampiran 2. Uji Kuantitatif Total Fenol Total fenol ekstrak dan fraksi diukur dengan metode kolorimetri Folin- Ciocalteu Heydari Majd et al. 2014. Secara ringkas sampel dipersiapkan dengan membuat larutan sampel dengan konsentrasi yang sesuai yakni sekitar 1000 ppm menggunakan etanol 80. Sebanyak 200 µl sampel ditambahkan pada 1 ml folin 10 dan 3 ml Na 2 CO 3 20. Larutan kemudian diaduk dengan vortex dan diinkubasi selama 2 jam dalam kondisi gelap. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 760 nm. Absorbansi sampel dibandingkan dengan absorbansi standar asam galat. Total fenol diekspresikan sebagai miligram setara asam galat per gram berat kering sampel. Uji Aktifitas Antioksidan Kemampuan antioksidan ekstrak dan fraksi dalam menangkap radikal bebas DPPH dianalisa dengan metode spektrofotometri berdasarkan Salazar- Aranda et al. 2011. Ekstrak dilarutkan dalam etanol 1 mgml kemudian sampel ekstrak dengan 8 konsentrasi yang berbeda-beda dipersiapkan dengan pengenceran bertingkat setiap jenis ekstrak dan fraksi memiliki kisaran 24 konsentrasi yang berbeda bergantung pada hasil uji coba sebelumnya. Dibuat campuran dengan volume total 1 ml yang terdiri atas 500 µl ekstrak dan 500 µl DPPH 125 µM dalam etanol. Campuran sampel kemudian divortex dan dibiarkan pada kondisi ruang gelap selama 30 menit. Absorbansi kemudian diukur pada 517 nm dengan spektrofotometer. Vitamin C digunakan sebagai kontrol positif. Kapasitas antioksidan dalam menangkap radikal bebas DPPH dihitung dengan rumus sebagai berikut: x 100 Dimana A adalah absorbansi kontrol DPPH dan etanol sedangkan B adalah absorbansi sampel DPPH, etanol dan sampel. Korelasi antara setiap konsentrasi dan persentase penangkapan radikal bebas diplot dan nilai IC 50 dihitung dengan interpolasi. Aktifitas antioksidan diekspresikan dengan IC 50 yakni konsentrasi efektif tiap ekstrak untuk menangkap 50 radikal bebas DPPH. Kultur sel Sel kanker MCF-7 ditumbuhkan pada media RPMI 1640 yang diperkaya dengan 10 fetal bovine serum FBS dan 100 UmL penicillin dan 100 ngmL streptomycin. Kultur sel ditumbuhkan pada suhu 37 o C dan kondisi atmosfer 5 CO 2 . Sub kultur sel dilakukan dengan metode standar sebagaimana telah dijelaskan pada Bab 3. Uji toksisitas menggunakan metode MTT Sel kanker MCF7 ditanam pada 96-well plates dengan jumlah sel 2 x 10 4 sellubang dengan media RPMI 1640 dan diinkubasi pada 37 o C dalam 5 CO 2 , selama 24 jam untuk memberikan kesempatan bagi sel untuk menempel. Medium kemudian diganti dengan medium segar yang mengandung ekstrak torbangun dengan dosis 1000; 500; 250;125; 62.5; 31.25; 16; dan 8 ppm dan diinkubasi lanjut selama 24 jam. Uji MTT dilakukan berdasarkan metode yang telah dijelaskan pada Bab 3.

4.3 Hasil dan Pembahasan

Tanaman P. amboinicus yang dikaji dalam penelitian ini telah dikenal memiliki karakteristik nutrisi dan terapi yang merupakan kontribusi dari komponen fitokimia yang terkandung di dalamnya Arumugam et al. 2016. Proses ekstraksi dalam studi ini menggunakan satu jenis pelarut yakni etanol sehingga menghasilkan satu ekstrak sedangkan fraksinasi menggunakan berbagai pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda sehingga menghasilkan empat fraksi yang merupakan turunan dari ekstrak etanol tersebut yakni fraksi heksana, fraksi kloroform, fraksi etil asetat dan fraksi air. Perbedaan pelarut dalam proses ekstraksi menghasilkan ekstrak dan fraksi dengan jenis dan jumlah kandungan komponen yang berbeda. Hasil uji kualitatif menunjukkan bahwa ekstrak etanol kaya akan komponen fenolik yang diindikasikan dengan keberadaan flavonoid, tanin dan saponin Tabel 4.1. Adapun pada fraksi terlihat bahwa komponen fenolik lebih banyak terkumpul pada fraksi dengan tingkat kepolaran yang tinggi yakni fraksi 25 air maupun etil asetat. Sebaliknya keberadaan komponen fenolik tersebut hanya sedikit bahkan absen pada fraksi dengan tingkat kepolaran rendah seperti heksana dan kloroform. Adapun komponen steroid yang bersifat non polar lebih banyak terdapat pada fraksi heksana dan kloroform. Tabel 4.1 Hasil Pengujian fitokimia secara kualitatif Sampel Flavon- oid Alkaloid Tanin Saponin Quinon Steroid Triterpen- Oid M W D Etanol +++ - - - +++ + - ++ - Heksana + - - - - - - +++ - Kloroform ++ - - - - - - +++ - F Etil ++ - - - +++ - - + - F Air +++ - - - +++ +++ - + - Ket: M Mayer; W Wagner; D Dragendrof. Tanda + mengindikasikan keberadaan komponen. Uji kualitatif dalam studi ini menunjukkan pula bahwa ekstrak etanol tanaman ini tidak mengandung alkaloid, quinon dan triterpenoid. Hasil ini berbeda dengan penelitian Patel et al. 2010 yang melaporkan bahwa pada tanaman P amboinicus terkandung alkaloid, quinon dan terpenoid selain komponen fenolik dan steroid. Perbedaan ini kemungkinan disebabkan karena metode ekstraksi yang digunakan. Pada studi yang dilakukan oleh Patel et al. 2010 proses ekstraksi dilakukan menggunakan petroleum eter kemudian dari ampas yang tersisa diekstrak kembali menggunakan beberapa pelarut lain dengan kepolaran yang semakin meningkat yakni kloroform, etanol dan air. Dengan metode tersebut, keseluruhan komponen fitokimia dalam tanaman dapat terekstrak karena apabila tidak tertangkap oleh pelarut dengan kepolaran rendah maka akan tertangkap oleh pelarut dengan kepolaran yang lebih tinggi. Berbeda halnya dengan metode ekstraksi dalam studi ini yang pada dasarnya hanya dilakukan oleh pelarut etanol 80, sementara fraksinya hanya merupakan turunan dari ekstrak etanol. Dengan demikian komponen fitokimia yang diperoleh hanyalah komponen yang dapat terekstrak oleh etanol 80 tersebut. Gambar 4.1 Total fenol ekstrak dan fraksi daun torbangun. Error bar merupakan standar deviasi n = 3. Perbedaan huruf di atas batang menunjukkan perbedaan yang nyata P0,05 berdasarkan Uji Duncan