Analisis profil kimia fraksi torbangun Analisa HPLC
23
Bahan Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel tanaman
Torbangun yang diperoleh dari Kebun Percobaan IPB, Leuwikopo, Dramaga Bogor. Bahan untuk proses ekstraksi antara lain: pelarut etanol 97, n-heksana,
kloforom, etil asetat, aquades dan kertas saring. Sel yang digunakan adalah sel adenokarsinoma payudara galur MCF-7 yang disediakan oleh Laboratorium
Mikrobiologi dan Bioteknologi Pusat Studi Satwa Primata, IPB. Reagen-reagen dan
bahan untuk
kultur sel
seperti media
RPMI 1640,
FBS, penicillinstreptomycin, DMSO,
Dulbecco’s PBS, trypsin, dan trypane blue.
Peralatan penelitan
Peralatan untuk proses ekstraksi dan uji kimia yaitu freeze drier, sonikator, sentrifus, rotary evaporator, platform shaker, refrigerator, freezer, blender,
timbangan analitik, alat-alat gelas, vortex, vacuum filter, desikator, dan tabung sampel. Peralatan untuk kultur sel dan uji sitotoksisitas yaitu: incubator CO
2
, Biosafety cabinet Class 2, microscope fluorescence, hemocytometer, high speed
centrifuge, dan microplate reader.
Tahap persiapan sampel
Sampel daun torbangun Plectranthus amboinicus Lour. Spreng diekstrak dan difraksinasi sebagaimana prosedur yang telah dijelaskan pada Bab 3
terdahulu. Terdapat 5 fraksi yang akan diuji yakni ekstrak etanol, fraksi heksana, fraksi kloroform, fraksi etil asetat dan fraksi air.
Uji Fitokimia
Semua ekstrak dan fraksi diuji keberadaan komponen fitokimianya secara kuantitatif. Parameter uji fitokimia antara lain alkaloid, fenolik yang terdiri atas
flavonoid, tanin dan saponin, kemudian triterpenoid dan steroid serta hidrokuinon. Prosedur uji fitokimia tersaji dalam Lampiran 2.
Uji Kuantitatif Total Fenol
Total fenol ekstrak dan fraksi diukur dengan metode kolorimetri Folin- Ciocalteu Heydari Majd et al. 2014. Secara ringkas sampel dipersiapkan dengan
membuat larutan sampel dengan konsentrasi yang sesuai yakni sekitar 1000 ppm menggunakan etanol 80. Sebanyak 200 µl sampel ditambahkan pada 1 ml folin
10 dan 3 ml Na
2
CO
3
20. Larutan kemudian diaduk dengan vortex dan diinkubasi selama 2 jam dalam kondisi gelap. Absorbansi dibaca pada panjang
gelombang 760 nm. Absorbansi sampel dibandingkan dengan absorbansi standar asam galat. Total fenol diekspresikan sebagai miligram setara asam galat per gram
berat kering sampel.
Uji Aktifitas Antioksidan
Kemampuan antioksidan ekstrak dan fraksi dalam menangkap radikal bebas DPPH dianalisa dengan metode spektrofotometri berdasarkan Salazar-
Aranda et al. 2011. Ekstrak dilarutkan dalam etanol 1 mgml kemudian sampel ekstrak dengan 8 konsentrasi yang berbeda-beda dipersiapkan dengan
pengenceran bertingkat setiap jenis ekstrak dan fraksi memiliki kisaran
24
konsentrasi yang berbeda bergantung pada hasil uji coba sebelumnya. Dibuat campuran dengan volume total 1 ml yang terdiri atas 500 µl ekstrak dan 500 µl
DPPH 125 µM dalam etanol. Campuran sampel kemudian divortex dan dibiarkan pada kondisi ruang gelap selama 30 menit. Absorbansi kemudian diukur
pada 517 nm dengan spektrofotometer. Vitamin C digunakan sebagai kontrol positif. Kapasitas antioksidan dalam menangkap radikal bebas DPPH dihitung
dengan rumus sebagai berikut:
x 100 Dimana A adalah absorbansi kontrol DPPH dan etanol sedangkan B adalah
absorbansi sampel DPPH, etanol dan sampel. Korelasi antara setiap konsentrasi dan persentase penangkapan radikal bebas diplot dan nilai IC
50
dihitung dengan interpolasi. Aktifitas antioksidan diekspresikan dengan IC
50
yakni konsentrasi efektif tiap ekstrak untuk menangkap 50 radikal bebas DPPH.
Kultur sel
Sel kanker MCF-7 ditumbuhkan pada media RPMI 1640 yang diperkaya dengan 10 fetal bovine serum FBS dan 100 UmL penicillin dan 100 ngmL
streptomycin. Kultur sel ditumbuhkan pada suhu 37
o
C dan kondisi atmosfer 5 CO
2
. Sub kultur sel dilakukan dengan metode standar sebagaimana telah dijelaskan pada Bab 3.
Uji toksisitas menggunakan metode MTT
Sel kanker MCF7 ditanam pada 96-well plates dengan jumlah sel 2 x 10
4
sellubang dengan media RPMI 1640 dan diinkubasi pada 37
o
C dalam 5 CO
2
, selama 24 jam untuk memberikan kesempatan bagi sel untuk menempel. Medium
kemudian diganti dengan medium segar yang mengandung ekstrak torbangun dengan dosis 1000; 500; 250;125; 62.5; 31.25; 16; dan 8 ppm dan diinkubasi
lanjut selama 24 jam. Uji MTT dilakukan berdasarkan metode yang telah dijelaskan pada Bab 3.