Mekanisme Apoptosis Komponen Bioaktif Tanaman Torbangun Menghambat Viabilitas Dan Mendorong Apoptosis Sel Kanker Payudara Mcf 7

15 3 METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2014 hingga Mei 2016 di beberapa Laboratorium sebagai berikut:  SEAFAST Center South East Asian Food and Agricultural Science and Technology IPB,  Laboratorium Mikrobiologi dan Immunologi PSSP Pusat Studi Satwa Primata IPB,  Kebun Percobaan Leuwikopo IPB,  Laboratarium Kimia Pangan ITP IPB,  Laboratorium Jasa Analisis LJA IPB,  Laboratorium Pelayanan Kimia Analitik Balai Penelitian Ternak Ciawi,  Laboratorium BPPT Biotek Serpong,  dan Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB.

3.2 Bahan dan Alat Penelitian Bahan

Bibit tanaman torbangun Plectranthus amboinicus Lour. Spreng diperoleh dari Pusat Studi Biofarmaka IPB Cikabayan. Spesimen tanaman telah diautentikasi oleh Pusat Penelitian Biologi, LIPI Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Cibinong Bogor Surat Keterangan Identifikasi Tumbuhan terdapat pada Lampiran 1. Pelarut yang digunakan untuk proses ekstraksi antara lain: etanol absolut, n-heksana, kloforom, dan etil asetat diperoleh dari Merck- Germany. Kertas saring Whatman No. 42 untuk menyaring ekstrak. Berbagai pelarut standar HPLC untuk analisa HPLC dan LC-MS terdiri atas metanol, air HPLC, asam asetat, asetonitril, dan asam format. Filter membran ukuran pori 0.45 µm berbahan nylon Minisart Sartorius digunakan untuk preparasi sampel. Sel yang digunakan adalah sel adenokarsinoma payudara galur MCF-7 yang disediakan oleh PSSP IPB berasal dari ATCC® American Type Culture Collection. Reagen dan bahan untuk kultur sel dan uji biologis antara lain: medium Roswell Park Memorial Institute RPMI 1640 Sigma-Aldrich USA, fetal bovine serum FBS Gibco, penicillinstreptomycin, dimethyl sulfoxide DMSO, Merck-Germany, larutan penyangga Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline DPBS, Gibco, trypsin, trypane blue, 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,2- diphenyltetrazolium bromide MTT, Rneasy Mini Kit Qiagen untuk ekstraksi RNA, dan iCycler One-Step qRealTime-PCR Kit KAPA BIOSYSTEMS. Peralatan penelitan Peralatan untuk proses ekstraksi yaitu refrigerator, freeze drier Martin Christ Gamma 2-16 LSC plus, Germany, freezer, blender, timbangan analitik Sartorius, alat-alat gelas, vortex, sonicator, sentrifus kapasitas besar IEC Centra-8 Thermo Scientific, USA, platform shaker Innova 2100 Fisher Scientific, rotary evaporator Buchi, Switzerland, vacuum filter, desikator, dan 16 tabung sampel. Peralatan HPLC yang digunakan adalah Agilent Technologies, USA dengan Multi Wavelength Detector MWD. Kolom C18 150 mm x 4.6 mm i.d., ukuran partikel 5 µm. Sistem LC-MS yang digunakan yaitu UPLC- QToF-MSMS Waters dan kolom Acquity UPLC BEH C18 50 mm x 2.1 mm i.d., ukuran partikel 1.7 µm dengan XEVO-G2QTOF Waters, USA, model resolusi ESI positif dan MassLynk versi 4.1. Peralatan untuk kultur sel dan analisa bioteknologi yaitu: incubator CO 2 , Biosafety cabinet Class 2 NuAire, USA, microscope fluorescence Nikon Optivat-2, Japan, hemocytometer, high speed centrifuge, microplate reader Bio-Rad, USA, dan Real Time-PCR system Bio- Rad, USA. 3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Budidaya tanaman torbangun

Tanaman torbangun ditanam di Kebun Percobaan Leuwikopo IPB yang lokasinya terletak pada posisi Lintang: -6.563682, dan Bujur: 106.725537 NASA 2016. Lahan terlebih dahulu dipersiapkan dengan membuat bedengan dan mengaplikasikan pupuk kandang pada titik titik di mana bibit akan diletakkan. Jarak antar tanaman diperkirakan sekitar 40 cm. Tanaman dibiarkan dalam kondisi tidak ternaungi untuk memberikan peluang produksi metabolit sekunder yang optimal karena induksi panas, cahaya dan sinar UV Akula dan Ravishankar 2011. Berdasarkan data yang diperoleh dari Badan Meteorologi, Klimatologi dan Geofisika BMKG, curah hujan rata-rata per hari selama periode penanaman dan pemanenan 21 November 2014 – 9 Maret 2015 adalah 8.57 ± 14.64 mm. Curah hujan dalam bulan Desember 2014 adalah 200 mm yang tergolong menengah BMKG 2016. Sedangkan rata-rata lama penyinaran sinar matahari adalah 3.94 ± 2.53 jamhari. Tanaman dirawat dari hama dan gulma secara manual tanpa penggunaan pestisida. Penyiraman tanaman dilakukan setiap dua hari apabila diperlukan. Gambar 3.1 Tanaman torbangun yang ditanam di Kebun Percobaan Leuwikopo IPB. A Usia tanam 0 minggu saat baru dipindah dari polybag ke lahan, B usia tanam 10 minggu saat tanaman siap dipanen 17 Ekstraksi dan fraksinasi tanaman torbangun Pengambilan sampel Prosedur pengambilan sampel dilaksanakan berdasarkan metode Andarwulan et al. 2014 dengan sedikit modifikasi. Secara ringkas tanaman torbangun dipanen dengan memotong daun yang tumbuh sekitar 15 cm dari ujung tiap cabang. Daun yang bersih dan bebas dari kerusakan dipilih dan langsung dikemas dalam plastik bersegel untuk kemudian langsung disimpan dalam freezer -20 o C selama menunggu proses pengeringan beku. Sampel daun torbangun kemudian diliofilisasi dengan freeze dryer selama 2 x 24 jam. Daun torbangun kering kemudian dihaluskan menggunakan blender dan disaring dengan penyaring ukuran 30 mesh. Bubuk halus dimasukkan dalam kemasan plastik bersegel masing-masing 25gkemasan, kemudian disimpan dalam freezer hingga proses selanjutnya Andarwulan et al. 2014. Ekstraksi dan fraksinasi komponen bioaktif Proses ekstraksi secara umum diadaptasi dari metode Maser et al. 2015. Sejumlah bubuk sampel daun torbangun 25 g dicampur dengan 500 ml etanol 80 dalam wadah erlenmeyer 500 ml sehingga diperoleh perbandingan sampel:pelarut 1:20, mv. Untuk mengoptimumkan proses pengadukan maka 3 butir kelereng dimasukkan ke dalam campuran kemudian erlenmeyer dinaikkan ke atas platform shaker untuk diaduk selama 20 menit dengan kecepatan 125 rpm. Setelah itu campuran disonikasi dalam penangas ultrasound selama 50 menit. Kemudian dilakukan sentrifugasi selama 5 menit pada putaran 2000 rpm sehingga ekstrak yang menjadi supernatan dengan mudah dipisahkan dengan dekantasi. Ekstrak disaring dengan kertas Whatman no 42 dalam kondisi vakum. Filtrat kemudian ditempatkan pada botol kaca berwarna gelap, sedangkan retentate dan bubuk yang tersisa ditambahkan etanol 80 sebanyak 375 ml 1:15, mv untuk kemudian dilakukan ekstraksi kembali dengan metode yang sama seperti ekstraksi tahap pertama. Dari 100 gr bubuk sampel diperoleh total ekstrak sebanyak ± 3 liter. Filtrat kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator pada temperatur 50 o C sehingga diperoleh ekstrak etanol tanaman torbangun. Proses ekstraksi dilakukan dengan 3 kali ulangan 3 x 100 g bubuk. Ekstrak etanol pekat dibagi menjadi dua bagian yang salah satu bagian disimpan sebagai ekstrak etanol sedangkan bagian yang lain dilakukan fraksinasi. Proses fraksinasi cair-cair secara bertingkat dilaksanakan berdasarkan metode yang diadaptasi dari Maser et al. 2015 dengan sedikit modifikasi. Secara ringkas proses fraksinasi tersebut menggunakan beberapa pelarut dengan tingkat polaritas yang berbeda yakni heksana, kloroform dan etil asetat Gambar 3.2. Ekstrak etanol pekat sebanyak 7 g ditambahkan aquadest sebanyak 225 ml sehingga diperoleh perbandingan sampel:aquadest 1:30, mv. Dilakukan pengadukan sehingga sampel ekstrak etanol benar-benar larut. Kemudian larutan dimasukkan dalam labu pemisah dan ditambahkan heksana sebanyak 225 ml. Dilakukan pengadukan dengan mengocok labu pemisah selama 5 menit. Kemudian didiamkan utuk memberikan kesempatan terjadinya pemisahan antara fase polar dan fase non polar. Ketika terjadi pemisahan sempurna maka fraksi larut heksana yang bersifat non polar dipisahkan dan ditampung dalam wadah 18 botol kaca berwarna gelap. Sementara fraksi polar ditambahkan kembali dengan 225 ml heksana untuk dilakukan ekstraksi kembali seperti tahap sebelumnya. Fraksi polar hasil fraksinasi dengan heksana kemudian ditambahkan dengan kloroform untuk dilakukan fraksinasi sehingga diperoleh fraksi kloroform dan fraksi polarnya. Fraksi polar yang tersisa kemudian ditambahkan dengan etil asetat untuk dilakukan fraksinasi kembali sehingga diperoleh hasil akhir berupa fraksi etil asetat dan fraksi air. Masing-masing ekstraksi dan fraksinasi dilakukan sebanyak 3 kali ulangan. Gambar 3.2 Bagan alir proses ekstraksi dan fraksinasi bertingkat Bubuk sampel torbangun Ekstrak etanol + H 2 O Ekstraksi dengan etanol Filtrat Ekstrak etanol Corong pemisah Heksana Kloroform Fraksi polar + H 2 O Corong pemisah Etil asetat Fraksi polar + H 2 O Corong pemisah Fraksi heksana Fraksi kloroform Fraksi etil asetat Fraksi air 19 Gambar 3.3 Bagan alir identifikasi fraksi aktif tanaman torbangun

3.3.2 Analisis profil kimia fraksi torbangun Analisa HPLC

Gupta et al. 2013 Ekstrak dan fraksi torbangun dilarutkan dalam DMSO pada konsentrasi 0.8 µgml dan diaduk dengan vortex. Kemudian sebanyak 1 ml larutan difiltrasi menggunakan filter membran dan ditempatkan pada wadah vial. Sebanyak 40 µ l sampel diinjeksikan ke dalam HPLC. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 250 nm, 270 nm, 290 nm, 310 nm, 330 nm, dan 350 nm. Fase gerak sistem HPLC terdiri atas larutan asam asetat 0.1 A dan acetonitril B dengan gradien elusi 2-5 B 3 menit, 5-15 B 7 menit, 15-30 B 6 menit, dan 30- 2 B 4 menit. dengan laju aliran 1 mLmenit. Kromatogram yang dihasilkan dari 5 fraksi dengan 3 ulangan dan 3 serapan panjang gelombang UV akan diperoleh 45 kromatogram. Data kromatogram akan dikorelasikan dengan data aktifitas anti kanker terhadap sel MCF-7 menggunakan analisis multivariat OPLS. Penentuan fraksi aktif dengan metabolomik Fraksi yang mengandung komponen aktif ditentukan melalui analisa menggunakan OPLS. Analisa ini menghasilkan 3 jenis keluaran yaitu score plot, Y related coefficient plot, dan X varian plot. Score plot menunjukkan klasifikasi fraksi berdasarkan level nilai IC 50 . Y related coefficient plot memperlihatkan korelasi antara dua matriks yakni data selang waktu retensi dan data nilai IC 50 . Adanya korelasi yang signifikan ditunjukkan dengan Y related coefficient yang bernilai positif. Sedangkan X varian plot memperlihatkan penyebaran peak area dari berbagai fraksi pada selang waktu retensi yang signifikan aktifitasnya. Berdasarkan plot-plot tersebut maka dapat diketahui fraksi yang memiliki peak 5 Fraksi Torbangun Analisa HPLC Sel MCF7 MTT assay Metabolomik Fraksi paling aktif LC-MS Profil Komponen bioaktif IC 50 Kromatogram