Hasil dan Pembahasan Komponen Bioaktif Tanaman Torbangun Menghambat Viabilitas Dan Mendorong Apoptosis Sel Kanker Payudara Mcf 7

28 komponen yang berperan dalam menentukan tingginya kemampuan sitotoksik fraksi heksana dan kloroforom daun torbangun ini. Gambar 4.4 Kemampuan ekstrak dan fraksi daun torbangun dalam menghambat proliferasi sel kanker MCF-7. Gambar 4.5 Korelasi antara total fenolik dan kemampuan penghambatan proliferasi sel kanker MCF-7 ekstrak dan fraksi torbangun. Gambar 4.5 memperlihatkan bahwa komponen fenolik tidak memiliki korelasi dengan aktifitas anti proliferasi sel kanker dari ekstrak torbangun. Ini diperlihatkan dengan korelasi yang negatif dan nilai koefisien regresi yang sangat rendah. Penelitian pada ekstrak daun tanaman zaitun di Tunisia memperlihatkan bahwa kandungan komponen fenolik yang tinggi tidak berkorelasi dengan kemampuan penghambatan ekstrak terhadap beberapa sel kanker payudara yang diuji Taamalli et al. 2012. Akan tetapi peneliti dalam studi tersebut tetap berpendapat bahwa ada suatu komponen tertentu yang termasuk dalam golongan fenolik yang berperan dalam aktifitas anti-proliferasi sel kanker. 61,42 1,77 2,83 53,29 136,74 20 40 60 80 100 120 140 Etanol Heksana Kloroform Etil asetat Air IC50 µ g m l Sampel R² = 0,1014 y = 1,242x + 27,725 20 40 60 80 100 120 140 160 10 20 30 40 50 To ksi si tas IC50 p p m Total Fenolik mg GAEgr 29 Simpulan Komponen fitokimia dari ekstrak dan fraksi daun torbangun sebagian besar berupa golongan fenolik yang terdiri atas flavonoid, tannin dan saponin. Secara kuantitatif, kandungan total fenol tertinggi terdapat pada fraksi etil asetat yakni 42.15 mg GAEg sedangkan terendah pada fraksi heksan yakni 7.15 mg GAEg. Aktifitas antioksidan berupa penangkapan radikal bebas DPPH tertinggi diperlihatkan oleh fraksi etil asetat dengan nilai IC 50 4.22 ppm sedangkan terendah pada fraksi heksana dengan nilai IC 50 64.9 ppm. Terdapat korelasi positif meskipun tidak tinggi antara kandungan total fenol dan aktifitas antioksidan. Adapun aktifitas antiproliferasi sel kanker MCF-7 tertinggi dimiliki oleh fraksi heksana dengan nilai IC 50 1.77 µgml dan terendah diperlihatkan oleh fraksi air dengan nilai IC 50 136.74 µgml. Tidak terdapat korelasi antara kandungan total fenol dan kemampuan penghambatan viabilitas sel kanker MCF-7. 30 5 IDENTIFIKASI KOMPONEN BIOAKTIF DAUN TORBANGUN YANG BERSIFAT SITOTOKSIK TERHADAP SEL KANKER MCF-7 MENGGUNAKAN APLIKASI METABOLOMIK BERBASIS HPLC Abstract The objective of this study was to identify the active compounds in Plectranthus amboinicus Lour. Spreng which play a role to inhibit viability of breast cancer MCF-7 cells using HPLC-based metabolomics approach. Five fractions of the plant extract were observed including ethanol, hexane, chloroform, ethyl acetate and water fraction. There were 45 HPLC chromatograms resulted from 5 fractions with 3 replications and 3 wavelengths detection. The chromatograms were compared to the data of IC 50 from MTT assay of each fraction against human breast cancer MCF-7 cells using metabolomics. The OPLS analysis result promptly pointed towards a chloroform fraction at retention time of 40.16 - 41.28 min that has the greatest contribution to the cytotoxic activity. The data of mass spectra indicated that an abietane diterpene namely 7-acetoxy-6- hydroxyroyleanone was the main compound that contributed to the cytotoxic activity. This metabolomics application method can be used as a quick preliminary guideline to uncover the most dominant compound related to the bioactivity. Keywords: bioactive compounds; cytotoxicity; metabolomics; Plectranthus amboinicus Lour. Spreng.

5.1 Pendahuluan

Penyakit kanker menjadi penyebab kematian yang cukup tinggi di dunia. Kanker payudara merupakan jenis kanker yang terdiagnosis paling banyak pada kaum wanita dan menjadi penyebab tertinggi kematian di dunia, dengan perkiraan 1.7 juta kasus dan 521.900 kematian pada tahun 2012 Torre et al. 2015. Di Indonesia sendiri dari 1.5 juta kematian pada tahun 2014 berdasarkan data WHO 2014, sebanyak 8 persennya disebabkan oleh kanker. Dari sejumlah 92.200 kasus kanker pada wanita, sebanyak 48.998 kasus 21.4 merupakan kanker payudara WHO 2014. Masalah akibat kanker ini diperkirakan akan terus meningkat seiring peningkatan jumlah penduduk dan perubahan gaya hidup yang menjadi faktor pemicu terjadinya kanker Torre et al. 2012. Komponen bioaktif yang berasal dari alam mulai mendapatkan sorotan untuk dikembangkan sebagai terapi alternatif dalam menangani kanker karena dianggap memiliki efek samping yang lebih kecil dibandingkan dengan penggunaan kemoterapi. Tanaman merupakan sumber yang sangat kaya akan komponen metabolit sekunder alami yang saat ini banyak diteliti akan bioaktifitasnya untuk dikembangkan menjadi obat kanker Greenwell and Rahman 2015. Meskipun penemuan dan pengembangan obat baru berbasis produk alami mewakili upaya yang sangat kompleks dengan melibatkan pendekatan multidisiplin yang sangat terharmonisasi namun perkembangan ilmu pengetahuan 31 dan teknologi serta tren riset saat ini mengindikasikan bahwa produk alami akan menjadi sumber yang sangat penting untuk bahan obat di masa yang akan datang Atanasov et al. 2015. Tanaman torbangun Plectranthus amboinicus Lour. Spreng telah dimanfaatkan secara tradisional untuk mengobati beberapa macam penyakit seperti batuk kronis, bronchitis, asma, diare dan epilepsi Khare et al. 2011. Beberapa studi in vivo menggunakan hewan percobaan menunjukkan bahwa tanaman ini memiliki aktifitas analgesikdan anti inflamasi Chiu et al. 2012, anti- inflamasi dan anti tumor terhadap Sarcoma-180 dan Ehrlich ascites carcinoma Gurgel et al. 2009, anti rheumatoid arthritis Chang et al. 2007, aktifitas antimikroba terhadap Staphylococcus aureus de Oliveira et al. 2013. Studi in vitro juga melaporkan bahwa ekstrak tanaman ini memiliki kemampuan antioksidan dan anti bakteri Bhatt dan Negi 2012, anti ketombe Selvakumar et al. 2012 kemampuan perlindungan terhadap organ hati Patel 2011 dan aktifitas antifungal dalam system pangan Murthy et al. 2009. Meskipun banyak studi telah mengkaji secara luas bioaktifitas dari tanaman ini akan tetapi masih belum adanya kajian yang mengeksplorasi dan mengidentifikasi komponen yang bertanggung jawab terhadap kemampuan bioaktifitas tanaman tersebut. Pendekatan metabolomik memungkinkan untuk secara sistematik mempelajari camuran yang kompleks seperti sediaan fitokimia yang kemudian dikorelasikan dengan data observasi yang diperoleh dari uji biologis tanpa harus melakukan isolasi komponen aktif sebagaimana yang biasa dilakukan pada bioassay guided isolation Yuliana et al. 2011. Metabolomik berbasis High performance liquid chromatography HPLC-based metabolomics telah diaplikasikan untuk mengidentifikasi secara cepat komponen anti bakteri dari ekstrak buah takokak Turkey Berry Maser et al. 2015. Profil metabolit yang dihasilkan dari data HPLC yang menggunakan detektor Multi Wavelength Detector HPLC-MWD dikorelasikan dengan data aktifitas anti bakteri yang diperoleh dari metode well diffusion agar. Korelasi dilakukan menggunakan orthogonal projection to latent structure OPLS. Komponen-komponen pada area puncak dari kromatogram HPLC yang memiliki korelasi tinggi dengan aktifitas anti bakteri dikumpulkan menggunakan HPLC semi-preparative dan diidentifikasi menggunakan liquid chromatography-mass spectrometry LC-MS. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi komponen aktif dalam tanaman torbangun yang berperan dalam menghambat proliferasi sel kanker MCF-7 menggunakan pendekatan metabolomik berbasis HPLC. 5.2 Bahan dan Metode Bahan tanaman dan kultur sel Plectranthus amboinicus Lour. Spreng dipersiapkan berdasarkan metode yang telah dijelaskan secara terperinci pada Bab 3. Galur sel kanker payudara manusia MCF-7 disediakan oleh Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Studi Satwa Primata IPB. Bahan kimia Etanol, n-heksana, kloroform, etil asetat untuk ekstraksi berasal dari Merck Germany. Metanol dan air HPLC menggunakan JT Baker USA. DMSO, 32 asetonitril, asam asetat glacial dibeli dari Merck Germany. MTT 3-4,5- dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide dan media RPMI 1640 dibeli dari Sigma-Aldrich USA. Ekstraksi dan fraksinasi tanaman Daun segar yang telah dipanen diliofilisasi dengan freeze drier Martin Christ Gamma selama 48 jam dan dijadikan bubuk menggunakan blender dan dilewatkan melalui ayakan 30 mesh. Bubuk ditimbang setiap 25 g dan ditempatkan dalam plastik bersegel kemudian disimpan dalam freezer hingga saat digunakan. Ekstraksi dan fraksinasi . Sampel torbangun diekstraksi dengan etanol 80 kemudian difraksinasi dengan pelarut heksana, kloroform, etil asetat secara bertingkat sesuai prosedur yang telah dijelaskan pada Bab 3. Uji toksisitas menggunakan metode MTT Uji toksisitas dari ekstrak dan fraksi daun torbangun dilakukan dengan metode colorimetri MTT 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Uji ini mengukur kemampuan sel hidup untuk menyerap dan mengkorversi MTT terlarut menjadi kristal formazan. Sel MCF-7 yang telah dipersiapkan sebelumnya dan tumbuh secara eksponensial ditanam pada 96 well plate dengan kepadatan sel awal 5 x 10 3 selsumur dan diinkubasikan selama 48 jam untuk member kesempatan agar sel menempel. Media kemudian diganti dengan media yang mengandung ekstrakfraksi daun torbangun dengan berbagai konsentrasi kemudian diinkubasi selama 48 jam. Setelah itu sejumlah 10 µl MTT 5000 ppm ditambahkan pada setiap sumur dan diinkubasi selama 4 jam. Media kemudian diganti dengan 100 µl etanol 96 pada setiap sumur untuk melarutkan kristal formazan yang terbentuk. Pengamatan absorbansi dilakukan dengan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Persentasi penghambatan sel oleh perlakuan dibandingkan dengan kontrol. Konsentrasi untuk menginduksi penghambatan proliferasi sebesar 50 IC 50 dihitung secara grafik menggunakan analisis Probit Chen et al. 2012. Analisis HPLC Ekstrak dan fraksi torbangun dilarutkan dalam DMSO pada konsentrasi 0.8 µgmL dan diaduk dengan vortex. Kemudian sebanyak 1 mL larutan difiltrasi menggunakan filter membran dan ditempatkan pada wadah vial. Sebanyak 40 µL sampel diinjeksikan ke dalam HPLC. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 250 nm, 270 nm, 290 nm, 310 nm, 330 nm, dan 350 nm. Fase gerak sistem HPLC terdiri atas larutan asam asetat 0.1 A dan acetonitril B dengan gradien elusi 2-5 B 3 menit, 5-15 B 7 menit, 15-30 B 6 menit, dan 30- 2 B 4 menit. dengan laju aliran 1 mLmenit. Kromatogram yang dihasilkan dari 5 fraksi dengan 3 ulangan dan 3 serapan panjang gelombang UV akan diperoleh 45 kromatogram. Analisis Metabolomic Data kromatogram HPLC secara manual dimasukkan ke dalam file Excel Microsoft. Matriks data X diperoleh dari area peak yang dikelompokkan ke dalam kolom-kolom yang berupa interval waktu retensi dengan lebar yang sama 33 setiap 0.16 menit waktu retensi. Sementara data IC 50 dijadikan sebagai matriks data Y namun ditransformasi terlebih dahulu menjadi 1IC 50 tersaji dalam Lampiran 4. Semua data kemudian ditransfer ke dalam SIMCA ® software Version 14, Umetrics, Sweden untuk dianalisa dengan OPLS Maser et al. 2015. Isolasi komponen bioaktif menggunakan HPLC semi preparatif Fraksi terpilih yang mengandung puncak yang menjadi target berdasarkan analisis metabolomik diisolasi menggunakan metode preparasi HPLC yang sama sebagaimana disebutkan sebelumnya. Kondisi running HPLC juga sama hanya seja menggunakan 1 panjang gelombang sesuai dengan yang terpilih berdasarkan analisis metabolomik. Selain itu, kolom dengan ukuran yang lebih besar juga menjadi pembeda untuk mengakomodasi 200 µL volume sampel dalam satu kali injeksi. Komponen yang terelusi pada waktu retensi target dikumpulkan dan ditempatkan dalam wadah vial kaca gelap ukuran 5 ml. Sample hasil isolasi dihembus gas nitrogen kemudian ditutup rapat dan di seal dengan parafilm sebelum dianalisa LC-MS. Analisis LC-MS untuk mengidentifikasi komponen bioaktif Sampel dilarutkan dengan DMSO sebelum diinjeksi untuk analisis LC- MS. Sistem LC-MS yang digunakan adalah UPLC-QTOF-MSMS: Waters yang dilengkapi kolom UPLC BEH C 18 ukuran partikel 1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm dan MS dengan XEVO-G2QTOF Waters pada mode resolusi ESI positive dan MassLynk software v. 4.1. fase gerak terdiri atas 0,1 asam formiat dalam air A dan 0,1 asam formiat dalam asetonitril B. Elusi dilakukan dengan gradient sebagai berikut:: 5 B 1 menit, 5-100 B 5 menit, 100 B 1 menit, 100-5 B 0,5 menit, dan 5 B 1,5 menit. Total running time adalah 9 menit dengan laju aliran 0,3 mlmenit pada suhu 40 o C. Identitas komponen ditentukan berdasarkan pola fragmentasi spektra massa yang dibandingkan dengan literatur. 5.3 Hasil dan Pembahasan Aktifitas penghambatan proliferasi sel MCF-7 Hasil uji MTT menunjukkan bahwa fraksi kloroform memiliki kemampuan akti kanker tertinggi yang diperlihatkan dengan rata-rata nilai konsentrasi penghambatan 50 viabilitas sel IC 50 yang rendah terhadap MCF-7 yakni 2.46 µgml diikuti oleh fraksi heksan 8.85 µgml, ekstrak etanol 50.3 µgml, fraksi air 81.78 µgml dan fraksi etil asetat 95.85 µgml Tabel 5.1. Nilai IC 50 ekstrak etanol pada penelitian ini lebih baik dibandingkan penelitian pada ekstrak batang P amboinicus yang hanya memiliki IC 50 995 µgml Bhatt et al. 2013. Ini sesuai dengan studi yang dilakukan oleh Bhattacharjee 2010 yang melaporkan bahwa ekstrak etanol dari daun tanaman ini memiliki bioaktifitas yang lebih tinggi dibandingkan bagian lain seperti batang dan akar. Hal ini disebabkan karena kandungan phenolic, flavonoid, alkaloid and saponin yang lebih tinggi pada daun dibandingkan bagian tanaman lainnya. Fraksi-fraksi non polar seperti kloroform dan heksan pada penelitian ini cenderung memiliki aktifitas sitotoksik yang lebih tinggi dibandingkan fraksi yang bersifat polar atau semi polar seperti etanol, air dan etil asetat. Hal ini dapat 34 berarti bahwa komponen bioaktif yang berkaitan dengan kemampuan sitotoksik adalah komponen yang bersifat non polar. Komponen diterpenoid non polar yang diisolasi dari resin Pinus massoniana memperlihatkan aktifitas sitotoksik yang kuat terhadap sel kanker epidermis A431 dan A549 sedangkan komponen diterpenoid dengan polaritas yang tinggi tidak memperlihatkan adanya aktifitas Yang et al. 2010. Gugus hidrofobik dan area hidrofilik pada suatu komponen merupakan faktor penentu dalam optimalisasi proses masuknya komponen menembus membran sel untuk menciptakan efek bioaktifitas. Hal ini didasari studi kasus pada aktifitas anti bakteri berdasarkan kajian struktur dan aktifitasnya Urzua et al. 2008. Pada penelitian ini tidak dilakukan identifikasi kandungan komponen tiap fraksi, melainkan langsung dilakukan analisa HPLC untuk mendapatkan profil kimia dari kromatogram setiap fraksi tersebut. Analisis metabolomik kemudian memprediksi puncak sebagai perwakilan komponen atau kelompok komponen di dalam fraksi yang berkontribusi dominan terhadap bioaktifitas. Tabel 5.1 Nilai konsentrasi penghambatan IC 50 dari ekstrak etanol tanaman torbangun terhadap sel MCF-7 Kode Sampel IC 50 µgml IC 50 µgml EtOH1 89.59 ± 30.26 EtOH2 40.47 ± 5.21 50.30 ± 20.44 EtOH3 20.85 ± 11.09 Hex1 5.30 ± 0.75 Hex2 10.04 ± 1.97 8.85 ± 1.80 Hex3 11.21 ± 2.99 Chlo1 3.41 ± 0.19 Chlo2 2.43 ± 0.45 2.46 ± 0.53 Chlo3 1.55 ± 0.31 Etil1 84.20 ± 13.61 Etil2 100.07 ± 8.03 95.85 ± 5.90 Etil3 103.29 ± 8.11 Water1 83.59 ± 19.96 Water2 96.66 ± 30.33 81.78 ± 9.15 Water3 65.09 ± 19.52 Nilai adalah rataan ± simpangan baku n = 3. Nilai-nilai ini yang dibandingkan dengan profil kimia masing-masing fraksi menggunakan metabolomics. Nilai adalah rataan di setiap fraksi ± galat baku dari rataan n = 3. Angka dalam kode sampel menunjukkan ulangan Perbedaan polaritas pelarut dalam ekstraksi mengakibatkan perbedaan konsentrasi phenolic, flavonoids dan tannin terkondensasi dari ekstrak sebagaimana yang dilaporkan oleh Metrouh-Amir et al. 2015. Yakni fraksi yang kaya akan phenolics dan flavonoids terdapat pada fraksi yang bersifat semi polar, sementara komponen tannin terkondensasi banyak terdapat pada fraksi-fraksi non polar. Verpoorte et al. 2008 mengelompokkan tiga jenis komponen dalam tanaman sebagai petunjuk untuk menentukan metode ekstraksi pelarut: 1