28
komponen yang berperan dalam menentukan tingginya kemampuan sitotoksik fraksi heksana dan kloroforom daun torbangun ini.
Gambar 4.4 Kemampuan ekstrak dan fraksi daun torbangun dalam menghambat proliferasi sel kanker MCF-7.
Gambar 4.5 Korelasi antara total fenolik dan kemampuan penghambatan proliferasi sel kanker MCF-7 ekstrak dan fraksi torbangun.
Gambar 4.5 memperlihatkan bahwa komponen fenolik tidak memiliki korelasi dengan aktifitas anti proliferasi sel kanker dari ekstrak torbangun. Ini
diperlihatkan dengan korelasi yang negatif dan nilai koefisien regresi yang sangat rendah. Penelitian pada ekstrak daun tanaman zaitun di Tunisia memperlihatkan
bahwa kandungan komponen fenolik yang tinggi tidak berkorelasi dengan kemampuan penghambatan ekstrak terhadap beberapa sel kanker payudara yang
diuji Taamalli et al. 2012. Akan tetapi peneliti dalam studi tersebut tetap berpendapat bahwa ada suatu komponen tertentu yang termasuk dalam golongan
fenolik yang berperan dalam aktifitas anti-proliferasi sel kanker.
61,42
1,77 2,83
53,29 136,74
20 40
60 80
100 120
140
Etanol Heksana
Kloroform Etil asetat
Air
IC50 µ
g m
l
Sampel
R² = 0,1014 y = 1,242x + 27,725
20 40
60 80
100 120
140 160
10 20
30 40
50
To ksi
si tas
IC50 p p
m
Total Fenolik mg GAEgr
29
Simpulan
Komponen fitokimia dari ekstrak dan fraksi daun torbangun sebagian besar berupa golongan fenolik yang terdiri atas flavonoid, tannin dan saponin. Secara
kuantitatif, kandungan total fenol tertinggi terdapat pada fraksi etil asetat yakni 42.15 mg GAEg sedangkan terendah pada fraksi heksan yakni 7.15 mg GAEg.
Aktifitas antioksidan berupa penangkapan radikal bebas DPPH tertinggi diperlihatkan oleh fraksi etil asetat dengan nilai IC
50
4.22 ppm sedangkan terendah pada fraksi heksana dengan nilai IC
50
64.9 ppm. Terdapat korelasi positif meskipun tidak tinggi antara kandungan total fenol dan aktifitas antioksidan.
Adapun aktifitas antiproliferasi sel kanker MCF-7 tertinggi dimiliki oleh fraksi heksana dengan nilai IC
50
1.77 µgml dan terendah diperlihatkan oleh fraksi air dengan nilai IC
50
136.74 µgml. Tidak terdapat korelasi antara kandungan total fenol dan kemampuan penghambatan viabilitas sel kanker MCF-7.
30
5 IDENTIFIKASI KOMPONEN BIOAKTIF DAUN TORBANGUN YANG BERSIFAT SITOTOKSIK TERHADAP
SEL KANKER MCF-7 MENGGUNAKAN APLIKASI METABOLOMIK BERBASIS HPLC
Abstract
The objective of this study was to identify the active compounds in Plectranthus amboinicus Lour. Spreng which play a role to inhibit viability of breast cancer
MCF-7 cells using HPLC-based metabolomics approach. Five fractions of the plant extract were observed including ethanol, hexane, chloroform, ethyl acetate
and water fraction. There were 45 HPLC chromatograms resulted from 5 fractions with 3 replications and 3 wavelengths detection. The chromatograms
were compared to the data of IC
50
from MTT assay of each fraction against human breast cancer MCF-7 cells using metabolomics. The OPLS analysis result
promptly pointed towards a chloroform fraction at retention time of 40.16 - 41.28 min that has the greatest contribution to the cytotoxic activity. The data of mass
spectra
indicated that
an abietane
diterpene namely
7-acetoxy-6- hydroxyroyleanone was the main compound that contributed to the cytotoxic
activity. This metabolomics application method can be used as a quick preliminary guideline to uncover the most dominant compound related to the
bioactivity.
Keywords: bioactive compounds; cytotoxicity; metabolomics; Plectranthus amboinicus Lour. Spreng.
5.1 Pendahuluan
Penyakit kanker menjadi penyebab kematian yang cukup tinggi di dunia. Kanker payudara merupakan jenis kanker yang terdiagnosis paling banyak pada
kaum wanita dan menjadi penyebab tertinggi kematian di dunia, dengan perkiraan 1.7 juta kasus dan 521.900 kematian pada tahun 2012 Torre et al. 2015. Di
Indonesia sendiri dari 1.5 juta kematian pada tahun 2014 berdasarkan data WHO 2014, sebanyak 8 persennya disebabkan oleh kanker. Dari sejumlah 92.200 kasus
kanker pada wanita, sebanyak 48.998 kasus 21.4 merupakan kanker payudara WHO 2014. Masalah akibat kanker ini diperkirakan akan terus meningkat
seiring peningkatan jumlah penduduk dan perubahan gaya hidup yang menjadi faktor pemicu terjadinya kanker Torre et al. 2012.
Komponen bioaktif yang berasal dari alam mulai mendapatkan sorotan untuk dikembangkan sebagai terapi alternatif dalam menangani kanker karena
dianggap memiliki efek samping yang lebih kecil dibandingkan dengan penggunaan kemoterapi. Tanaman merupakan sumber yang sangat kaya akan
komponen metabolit sekunder alami yang saat ini banyak diteliti akan bioaktifitasnya untuk dikembangkan menjadi obat kanker Greenwell and Rahman
2015. Meskipun penemuan dan pengembangan obat baru berbasis produk alami mewakili upaya yang sangat kompleks dengan melibatkan pendekatan
multidisiplin yang sangat terharmonisasi namun perkembangan ilmu pengetahuan
31
dan teknologi serta tren riset saat ini mengindikasikan bahwa produk alami akan menjadi sumber yang sangat penting untuk bahan obat di masa yang akan datang
Atanasov et al. 2015.
Tanaman torbangun Plectranthus amboinicus Lour. Spreng telah dimanfaatkan secara tradisional untuk mengobati beberapa macam penyakit
seperti batuk kronis, bronchitis, asma, diare dan epilepsi Khare et al. 2011. Beberapa studi in vivo menggunakan hewan percobaan menunjukkan bahwa
tanaman ini memiliki aktifitas analgesikdan anti inflamasi Chiu et al. 2012, anti- inflamasi dan anti tumor terhadap Sarcoma-180 dan Ehrlich ascites carcinoma
Gurgel et al. 2009, anti rheumatoid arthritis Chang et al. 2007, aktifitas antimikroba terhadap Staphylococcus aureus de Oliveira et al. 2013. Studi in
vitro juga melaporkan bahwa ekstrak tanaman ini memiliki kemampuan antioksidan dan anti bakteri Bhatt dan Negi 2012, anti ketombe Selvakumar et
al. 2012 kemampuan perlindungan terhadap organ hati Patel 2011 dan aktifitas antifungal dalam system pangan Murthy et al. 2009. Meskipun banyak studi
telah mengkaji secara luas bioaktifitas dari tanaman ini akan tetapi masih belum adanya kajian yang mengeksplorasi dan mengidentifikasi komponen yang
bertanggung jawab terhadap kemampuan bioaktifitas tanaman tersebut.
Pendekatan metabolomik memungkinkan untuk secara sistematik mempelajari camuran yang kompleks seperti sediaan fitokimia yang kemudian
dikorelasikan dengan data observasi yang diperoleh dari uji biologis tanpa harus melakukan isolasi komponen aktif sebagaimana yang biasa dilakukan pada
bioassay guided isolation Yuliana et al. 2011. Metabolomik berbasis High performance liquid chromatography HPLC-based metabolomics telah
diaplikasikan untuk mengidentifikasi secara cepat komponen anti bakteri dari ekstrak buah takokak Turkey Berry Maser et al. 2015. Profil metabolit yang
dihasilkan dari data HPLC yang menggunakan detektor Multi Wavelength Detector HPLC-MWD dikorelasikan dengan data aktifitas anti bakteri yang
diperoleh dari metode well diffusion agar. Korelasi dilakukan menggunakan orthogonal projection to latent structure OPLS. Komponen-komponen pada
area puncak dari kromatogram HPLC yang memiliki korelasi tinggi dengan aktifitas anti bakteri dikumpulkan menggunakan HPLC semi-preparative dan
diidentifikasi menggunakan liquid chromatography-mass spectrometry LC-MS.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi komponen aktif dalam tanaman torbangun yang berperan dalam menghambat proliferasi sel kanker
MCF-7 menggunakan pendekatan metabolomik berbasis HPLC. 5.2 Bahan dan Metode
Bahan tanaman dan kultur sel
Plectranthus amboinicus Lour. Spreng dipersiapkan berdasarkan metode yang telah dijelaskan secara terperinci pada Bab 3. Galur sel kanker payudara
manusia MCF-7 disediakan oleh Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Studi Satwa Primata IPB.
Bahan kimia
Etanol, n-heksana, kloroform, etil asetat untuk ekstraksi berasal dari Merck Germany. Metanol dan air HPLC menggunakan JT Baker USA. DMSO,
32
asetonitril, asam asetat glacial dibeli dari Merck Germany. MTT 3-4,5- dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide dan media RPMI 1640
dibeli dari Sigma-Aldrich USA. Ekstraksi dan fraksinasi tanaman
Daun segar yang telah dipanen diliofilisasi dengan freeze drier Martin Christ Gamma selama 48 jam dan dijadikan bubuk menggunakan blender dan
dilewatkan melalui ayakan 30 mesh. Bubuk ditimbang setiap 25 g dan ditempatkan dalam plastik bersegel kemudian disimpan dalam freezer hingga saat
digunakan.
Ekstraksi dan fraksinasi . Sampel torbangun diekstraksi dengan etanol
80 kemudian difraksinasi dengan pelarut heksana, kloroform, etil asetat secara bertingkat sesuai prosedur yang telah dijelaskan pada Bab 3.
Uji toksisitas menggunakan metode MTT
Uji toksisitas dari ekstrak dan fraksi daun torbangun dilakukan dengan metode colorimetri MTT 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium
bromide. Uji ini mengukur kemampuan sel hidup untuk menyerap dan mengkorversi MTT terlarut menjadi kristal formazan. Sel MCF-7 yang telah
dipersiapkan sebelumnya dan tumbuh secara eksponensial ditanam pada 96 well plate dengan kepadatan sel awal 5 x 10
3
selsumur dan diinkubasikan selama 48 jam untuk member kesempatan agar sel menempel. Media kemudian diganti
dengan media yang mengandung ekstrakfraksi daun torbangun dengan berbagai konsentrasi kemudian diinkubasi selama 48 jam. Setelah itu sejumlah 10 µl MTT
5000 ppm ditambahkan pada setiap sumur dan diinkubasi selama 4 jam. Media kemudian diganti dengan 100 µl etanol 96 pada setiap sumur untuk melarutkan
kristal formazan yang terbentuk. Pengamatan absorbansi dilakukan dengan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Persentasi penghambatan sel
oleh perlakuan dibandingkan dengan kontrol. Konsentrasi untuk menginduksi penghambatan proliferasi sebesar 50 IC
50
dihitung secara grafik menggunakan analisis Probit Chen et al. 2012.
Analisis HPLC Ekstrak dan fraksi torbangun dilarutkan dalam DMSO pada konsentrasi 0.8
µgmL dan diaduk dengan vortex. Kemudian sebanyak 1 mL larutan difiltrasi menggunakan filter membran dan ditempatkan pada wadah vial. Sebanyak 40 µL
sampel diinjeksikan ke dalam HPLC. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 250 nm, 270 nm, 290 nm, 310 nm, 330 nm, dan 350 nm. Fase gerak
sistem HPLC terdiri atas larutan asam asetat 0.1 A dan acetonitril B dengan gradien elusi 2-5 B 3 menit, 5-15 B 7 menit, 15-30 B 6 menit, dan 30-
2 B 4 menit. dengan laju aliran 1 mLmenit. Kromatogram yang dihasilkan dari 5 fraksi dengan 3 ulangan dan 3 serapan panjang gelombang UV akan
diperoleh 45 kromatogram. Analisis Metabolomic
Data kromatogram HPLC secara manual dimasukkan ke dalam file Excel Microsoft. Matriks data X diperoleh dari area peak yang dikelompokkan ke
dalam kolom-kolom yang berupa interval waktu retensi dengan lebar yang sama
33
setiap 0.16 menit waktu retensi. Sementara data IC
50
dijadikan sebagai matriks data Y namun ditransformasi terlebih dahulu menjadi 1IC
50
tersaji dalam Lampiran 4. Semua data kemudian ditransfer ke dalam SIMCA ® software
Version 14, Umetrics, Sweden untuk dianalisa dengan OPLS Maser et al. 2015.
Isolasi komponen bioaktif menggunakan HPLC semi preparatif
Fraksi terpilih yang mengandung puncak yang menjadi target berdasarkan analisis metabolomik diisolasi menggunakan metode preparasi HPLC yang sama
sebagaimana disebutkan sebelumnya. Kondisi running HPLC juga sama hanya seja menggunakan 1 panjang gelombang sesuai dengan yang terpilih berdasarkan
analisis metabolomik. Selain itu, kolom dengan ukuran yang lebih besar juga menjadi pembeda untuk mengakomodasi 200 µL volume sampel dalam satu kali
injeksi. Komponen yang terelusi pada waktu retensi target dikumpulkan dan ditempatkan dalam wadah vial kaca gelap ukuran 5 ml. Sample hasil isolasi
dihembus gas nitrogen kemudian ditutup rapat dan di seal dengan parafilm sebelum dianalisa LC-MS.
Analisis LC-MS untuk mengidentifikasi komponen bioaktif
Sampel dilarutkan dengan DMSO sebelum diinjeksi untuk analisis LC- MS. Sistem LC-MS yang digunakan adalah UPLC-QTOF-MSMS: Waters yang
dilengkapi kolom UPLC BEH C
18
ukuran partikel 1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm dan MS dengan XEVO-G2QTOF Waters pada mode resolusi ESI positive dan
MassLynk software v. 4.1. fase gerak terdiri atas 0,1 asam formiat dalam air A dan 0,1 asam formiat dalam asetonitril B. Elusi dilakukan dengan gradient
sebagai berikut:: 5 B 1 menit, 5-100 B 5 menit, 100 B 1 menit, 100-5 B 0,5 menit, dan 5 B 1,5 menit. Total running time adalah 9 menit dengan
laju aliran 0,3 mlmenit pada suhu 40
o
C. Identitas komponen ditentukan
berdasarkan pola fragmentasi spektra massa yang dibandingkan dengan literatur. 5.3 Hasil dan Pembahasan
Aktifitas penghambatan proliferasi sel MCF-7
Hasil uji MTT menunjukkan bahwa fraksi kloroform memiliki kemampuan akti kanker tertinggi yang diperlihatkan dengan rata-rata nilai
konsentrasi penghambatan 50 viabilitas sel IC
50
yang rendah terhadap MCF-7 yakni 2.46 µgml diikuti oleh fraksi heksan 8.85 µgml, ekstrak etanol 50.3
µgml, fraksi air 81.78 µgml dan fraksi etil asetat 95.85 µgml Tabel 5.1. Nilai IC
50
ekstrak etanol pada penelitian ini lebih baik dibandingkan penelitian pada ekstrak batang P amboinicus yang hanya memiliki IC
50
995 µgml Bhatt et al. 2013. Ini sesuai dengan studi yang dilakukan oleh Bhattacharjee 2010 yang
melaporkan bahwa ekstrak etanol dari daun tanaman ini memiliki bioaktifitas yang lebih tinggi dibandingkan bagian lain seperti batang dan akar. Hal ini
disebabkan karena kandungan phenolic, flavonoid, alkaloid and saponin yang lebih tinggi pada daun dibandingkan bagian tanaman lainnya.
Fraksi-fraksi non polar seperti kloroform dan heksan pada penelitian ini cenderung memiliki aktifitas sitotoksik yang lebih tinggi dibandingkan fraksi
yang bersifat polar atau semi polar seperti etanol, air dan etil asetat. Hal ini dapat
34
berarti bahwa komponen bioaktif yang berkaitan dengan kemampuan sitotoksik adalah komponen yang bersifat non polar. Komponen diterpenoid non polar yang
diisolasi dari resin Pinus massoniana memperlihatkan aktifitas sitotoksik yang kuat terhadap sel kanker epidermis A431 dan A549 sedangkan komponen
diterpenoid dengan polaritas yang tinggi tidak memperlihatkan adanya aktifitas Yang et al. 2010. Gugus hidrofobik dan area hidrofilik pada suatu komponen
merupakan faktor penentu dalam optimalisasi proses masuknya komponen menembus membran sel untuk menciptakan efek bioaktifitas. Hal ini didasari
studi kasus pada aktifitas anti bakteri berdasarkan kajian struktur dan aktifitasnya Urzua et al. 2008. Pada penelitian ini tidak dilakukan identifikasi kandungan
komponen tiap fraksi, melainkan langsung dilakukan analisa HPLC untuk mendapatkan profil kimia dari kromatogram setiap fraksi tersebut. Analisis
metabolomik kemudian memprediksi puncak sebagai perwakilan komponen atau kelompok komponen di dalam fraksi yang berkontribusi dominan terhadap
bioaktifitas.
Tabel 5.1 Nilai konsentrasi penghambatan IC
50
dari ekstrak etanol tanaman torbangun terhadap sel MCF-7
Kode Sampel IC
50
µgml IC
50
µgml
EtOH1 89.59 ± 30.26
EtOH2 40.47 ± 5.21
50.30 ± 20.44 EtOH3
20.85 ± 11.09 Hex1
5.30 ± 0.75 Hex2
10.04 ± 1.97 8.85 ± 1.80
Hex3 11.21 ± 2.99
Chlo1 3.41 ± 0.19
Chlo2 2.43 ± 0.45
2.46 ± 0.53 Chlo3
1.55 ± 0.31 Etil1
84.20 ± 13.61 Etil2
100.07 ± 8.03 95.85 ± 5.90
Etil3 103.29 ± 8.11
Water1 83.59 ± 19.96
Water2 96.66 ± 30.33
81.78 ± 9.15 Water3
65.09 ± 19.52 Nilai adalah rataan ± simpangan baku n = 3. Nilai-nilai ini yang dibandingkan
dengan profil kimia masing-masing fraksi menggunakan metabolomics. Nilai adalah rataan di setiap fraksi ± galat baku dari rataan n = 3.
Angka dalam kode sampel menunjukkan ulangan
Perbedaan polaritas pelarut dalam ekstraksi mengakibatkan perbedaan konsentrasi phenolic, flavonoids dan tannin terkondensasi dari ekstrak
sebagaimana yang dilaporkan oleh Metrouh-Amir et al. 2015. Yakni fraksi yang kaya akan phenolics dan flavonoids terdapat pada fraksi yang bersifat semi polar,
sementara komponen tannin terkondensasi banyak terdapat pada fraksi-fraksi non polar. Verpoorte et al. 2008 mengelompokkan tiga jenis komponen dalam
tanaman sebagai petunjuk untuk menentukan metode ekstraksi pelarut: 1