8
dengan ekstrak hidroalkohol dan bentuk kering beku. Hasil menunjukkan bahwa total fenol tertinggi berasal dari ekstrak etil asetat ±59 kemudian ekstrak aseton
±52, ekstrak hidroalkohol ±33, bentuk kering beku ±25, ekstrak metanol ±23 dan ekstrak heksana ±11 mg GAEg ekstrak. Kandungan total fenol
tersebut sejalan dengan kemampuan bioaktifitasnya dimana kemampuan antioksidan tertinggi ditunjukkan oleh ekstrak etil asetat dan kemampuan
antibakteri tertinggi oleh ekstrak aseton Bhatt and Negi 2012.
Hasil uji aktifitas antioksidan oleh Bhattacharjee 2010 menunjukkan bahwa ekstrak etanol yang berasal dari bagian daun tanaman torbangun memiliki
aktifitas antioksidan tertinggi dibandingkan bagian tanaman lainnya yakni batang dan akar. Hal ini disebabkan karena kandungan total fenolik, flavonoid, alkaloid
dan saponin juga lebih tinggi pada bagian daun dibandingkan batang dan akarnya. Dilaporkan bahwa pada ekstrak daun torbangun terdapat total fenolik 19,62 ±
0.83, flavonoid 4,21 ± 0.39, alkaloid 4,3 ± 0,74 dan saponin 2,09 ± 0,33 dalam persen beratberat. Namun seluruh bagian tanaman ini memperlihatkan
keberadaan komponen alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, triterpenoid, sedangkan karotenoid hanya terdapat pada daun dan batangnya.
Gambar 2.1 Struktur kimia komponen fenolik sederhana kiri. Struktur kimia flavonoid kanan Garcia-Salas et al. 2010
Studi review menyebutkan bahwa komponen volatile utama pada daun torbangun yang berkontribusi terhadap bioaktifitasnya antara lain carvacrol,
thymol dan -caryophyllene Khare et al. 2011. Pada penelitian oleh Murthy et al. 2009 diperoleh komponen volatile utama yang bersifat fungitoxic adalah
carvacrol 70, -caryophyllene 6.2, p-cymene 5.6, -terpinene 5.3, 4-
terpinenol 1.2, α-cubebene 0.8, α-bergamotene γ.9, α-caryophyllene 1.9 dan eudesma-4,11-diene 1.8. Penelitian lain oleh Selvakumar et al,
2011 melaporkan komponen volatile pada minyak esensial tanaman torbangun yang memiliki kemampuan bioaktif didominasi oleh komponen thymol 41.3,
1,8-cineol 21.45 dan carvacrol 13.25.
2.3 Metabolomik
Produk alami telah diketahui merupakan sumber yang sangat kaya untuk memperoleh komponen bioaktif terutama dalam rangka penemuan obat karena
produk alami memiliki struktur kimia yang unik dan beragam. Namun dengan kompleksitas dan keberagaman metabolit yang terdapat dalam produk alami
tersebut justru menjadi hambatan tersendiri. Salah satu pendekatan yang dikembangkan untuk mengatasi hambatan tersebut adalah melalui metabolomik.
Pendekatan metabolomik memungkinkan untuk melakukan studi sistematik menggunakan campuran yang kompleks seperti preparasi fitokimia yang
9
kemudian dapat dihubungkan dengan pengamatan yang diperoleh melalui sistem uji biologis tanpa harus mengisolasi komponen-komponen aktifnya Yuliana et al.
2010.
Tujuan utama metabolomik adalah untuk mengukur semua metabolit dalam suatu organisme secara kualitas dan kuantitas, sehingga dapat memberikan
gambaran yang jelas mengenai organisme tersebut dalam kondisi tertentu Kim et al. 2010. Untuk menganalisa metabolome, terdapat lima pendekatan utama yang
saat ini digunakan yakni HPLC atauTLC-UV, GC-MS, LC-MS, MS
n
, dan NMR spektrofotometri. Masing-masing memiliki kelebihan dan kekurangan Tabel 2.2.
MS mass spectrometry dan NMR nuclear magnetic ressonance spektroskopi merupakan metode yang paling umum digunakan Verpoorte et al.
2008. MS biasanya digabungkan dengan pemisahan kromatografi seperti gas chromatography GC dan high performance liquid chromatography HPLC.
GC-MS memperlihatkan sensitifitas dan resolusi yang tinggi dan pola fragmentasi yang bersifat reproducible. Database komersial sangat membantu dalam
mengidentifikasi metabolit. Akan tetapi keterbatasan yang dimiliki GC-MS adalah rendahnya kisaran polaritas dan berat molekul yang dapat dideteksi. Komponen-
komponen dengan struktur yang kompleks seperti metabolit sekunder tanaman yang berbentuk glikosida tidak dapat dianalisa menggunakan GC-MS.
Tabel 2.2 Perbandingan metode analisis yang digunakan dalam metabolomik
HPLC TLC-UV
GC-MS LC-MS
MS
n
NMR
Preparasi sampel ++
- -
+ +++
Reproducibility -
+ -
+ +++
Absolute quantitation -
- -
- +++
Relative quantitation +
++ +
++ +++
Identitas +
++ ++
++ ++
Jumlah komponen ± 30
1000 200
1000 200
Kepekaan +
++ ++
+++ -
Skala dari – hingga +++ untuk sangat kurang hingga sangat baik
Sumber: Verpoorte et al. 2008 Untuk menganalisa metabolit yang polar digunakan metode soft ionisation
MS seperti electrospray ionization ESI, atmospheric pressure chemical ionization APCI atau matrix assisted laser desorption MALDI. Kelebihan
yang dimiliki oleh metabolomik berbasis MS ini adalah tingginya kisaran berat molekul dan polaritas serta akurasi berat molekul yang mampu dianalisa. Akan
tetapi kondisi ionisasi dan matriks mempengaruhi perbedaan sensitifitas molekul sehingga mengurangi reproducibility. Selain itu masih minimnya database pada
LC-MS mengharuskan untuk dilakukan identifikasi secara manual Verpoorte et al. 2008.
NMR pada mulanya hanya sebagai pelengkap bagi metode analisis yang lain. Namun dalam metabolomik, NMR memiliki kelebihan yang tidak dimiliki
oleh MS dan kromatografi. NMR memberikan analisis yang cepat dan terperinci
10
berupa komposisi biomolekul suatu ekstrak kasar. NMR merupakan detektor universal dimana setiap signal memberikan informasi langsung mengenai struktur
kimia suatu molekul. Spektrum NMR merupakan karakteristik fisik dari suatu komponen sehingga bersifat sangat reproducible. Ini menjadi kelebihan utama
NMR sehingga metabolomik berbasis data NMR dapat digunakan terus menerus selama metode ekstraksi dan pelarut NMR yang digunakan tetap sama Verpoorte
et al. 2008. Salah satu kendala dalam aplikasi NMR adalah biaya yang cukup signifikan sehingga dalam hal ini HPLC menjadi alternatif dan Maser et al. 2014
telah melaporkan keberhasilan penggunakan HPLC dalam metabolomik untuk mengidentifikasi komponen antibakteri buah takokak Solanum torvum Swart.
Penggunaan teknologi LC-MS berdasarkan review Wishart 2008 memiliki beberapa keunggulan antara lain sensitifitas yang tinggi, sampel dapat langsung
diinjeksi tanpa pemisahan terlebih dahulu, membutuhkan jumlah sampel yang minimum, mendeteksi hampir semua komponen organik dan sebagian anorganik.
Namun LC-MS ini memiliki beberapa kelemahan antara lain: tidak bersifat kuantitatif, membutuhkan waktu running yang cukup lama beberapa puluh menit
per sampel, resolusi pemisahan komponen kurang baik dan kurang reproducible, serta sulit mengidentifikasi komponen yang novel karena terbatasnya database.
Terdapat dua metode pendekatan dalam hal pemrosesan dan interpretasi data metabolomik yang berkembang saat ini. Pertama adalah pendekatan
chemometric di mana komponen-komponen kimia secara umum tidak diidentifikasi, melainkan pola spektra dan intensitasnya dicatat untuk kemudian
secara statistik dibandingkan untuk menentukan spektra tertentu yang menjadi pembeda antar kelompok Wishart 2008. Adapun pendekatan kedua adalah
metabolomik kuantitatif atau targeted profiling yang menitikberatkan pada usaha untuk mengidentifikasi dan atau mengkuantifikasi sebanyak mungkin komponen
di dalam sampel. Ini biasanya dilakukan dengan membandingkan data spektra NMR atau MS dari sampel dengan spektra komponen murni pada referensi atau
database. Begitu komponen teridentifikasi dan terkuantifikasi maka data kemudian diproses secara statistik untuk menentukan biomarker atau pathway
metabolik yang penting.
Data metabolomik deskriminatif biasanya mengandalkan metode multivariat seperti PCA Principal Component Analysis untuk pengelompokan
sampel. PCA membuat variabel baru komponen-komponen penting dengan kombinasi
linear dari
metabolit yang
terdeteksi bersamaan
dengan memaksimalkan variasi sampel. Sebaliknya PLS Partial Least Square
merupakan teknik MVDA Multi Variate Data Analysis yang memungkinkan mendiskriminasi sampel dengan memaksimalkan korelasi di antara variabel
Cevallos et al. 2009. Namun data PLS memiliki kelemahan yakni masih sulit diinterpretasi, masih banyak komponen PLS dan masih terdapat variasi orthogonal
pada variabel deskriptor X. O-PLS Orthogonal Projection to Latent Structure diajukan oleh Tryyg dan Wold 2002 untuk menyempurnakan metode PLS. O-
PLS menghilangkan variasi variabel X yang tidak berkorelasi dengan Y variabel terikat. Metode ini menghasilkan data yang lebih mudah diinterpretasi, lebih
sedikit komponen dan data yang lebih relevan.
