20
area terbesar yang diduga mengandung komponen bioaktif Maser et al. 2015. Fraksi yang terpilih kemudian akan digunakan untuk pengujian tahap berikutnya.
Identifikasi komponen bioaktif dengan LC-MS Maser et al. 2015
Sampel dilarutkan dengan 100 µL DMSO sebelum diinjeksi untuk analisis LC-MS sebanyak 5 µL dari larutan tersebut. Sistem LC-MS yang digunakan
adalah UPLC-QTOF-MSMS: Waters yang dilengkapi kolom UPLC BEH C
18
ukuran partikel 1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm dan MS dengan XEVO-G2QTOF Waters pada mode resolusi ESI positive dan MassLynk software v. 4.1. fase
gerak terdiri atas 0,1 asam formiat dalam air A dan 0,1 asam formiat dalam asetonitril B. Elusi dilakukan dengan gradient sebagai berikut:: 5 B 1 menit,
5-100 B 5 menit, 100 B 1 menit, 100-5 B 0,5 menit, dan 5 B 1,5 menit. Total running time adalah 9 menit dengan laju aliran 0,3 mlmenit pada
suhu 40
o
C. Identitas komponen ditentukan berdasarkan pola fragmentasi spektra massa yang dibandingkan dengan literatur.
3.3.3 Kultur sel dan Uji Bioaktifitas
Sel kanker MCF-7 ditumbuhkan pada media RPMI 1640 yang diperkaya dengan 10 fetal bovine serum FBS dan 100 UmL penicillin dan 100 ngmL
streptomycin. Kultur sel ditumbuhkan pada suhu 37
o
C dan kondisi atmosfer 5 CO
2
. Untuk menentukan jumlah sel maka sel dipanen dengan diberi trypsin selama beberapa saat tertentu, kemudian diwarnai mengunakan trypan blue dan
sel dihitung menggunakan hemocytometer. Sub kultur dilakukan sesuai prosedur ATCC dan inokulum dengan jumlah sel hidup 2 x 10
4
hingga 4 x 10
4
selcm
2
yang digunakan untuk proses selanjutnya.
Uji toksisitas menggunakan MTT assay
Prinsip dari uji MTT ialah mengukur kemampuan sel hidup dalam menyerap dan mengkonversi MTT terlarut menjadi kristal formazan. Sel MCF-7
ditanam dalam 96-well plate dengan kepadatan 5 x 10
3
selsumur dan diinkubasi 24 jam. Media kemudian diganti dengan media segar yang mengandung fraksi
torbangun dengan konsentrasi berbeda dan diinkubasi selama 48 jam. MTT 3- 4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,2-diphenyltetrazolium bromide sebanyak 10 µl 5000
ppm ditambahkan pada tiap sumur dan diinkubasi selama 4 jam. Media diganti dengan 100 µl etanol 96 untuk melarutkan formazan yang terbentuk.
Absorbansi dibaca pada 595 nm menggunakan microplate reader. Persentase inhibisi diekspresikan dengan persentase inhibisi sampel dibandingkan dengan
persentase inhibisi kontrol. Konsentrasi penghambatan inhibitory concentration IC
50
adalah konsentrasi yang menghambat 50 pertumbuhan sel dan dihitung dengan grafik menggunakan metode Probit Chen et al. 2012. Contoh
perhitungan IC
50
dapat dilihat pada Lampiran 3.
21
4 EKSTRAKSI DAN FRAKSINASI KOMPONEN BIOAKTIF
DAUN TORBANGUN SERTA POTENSINYA SEBAGAI ANTIOKSIDAN DAN PENGHAMBAT VIABILITAS SEL
KANKER MCF-7
Abstract
The aim of this study was to examine the phytochemical compounds of Plectranthus amboinicus Lour. Spreng and to observe their bioactivity as
antioxidant as well as anti proliferation of breast cancer cell MCF-7. Five fractions of the plant extract were observed including ethanol, hexane,
chloroform, ethyl acetate and water fraction. Result showed that phytochemical compounds of the plant extract and fraction are mainly phenolic group which
consist of flavonoid, tannin and saponin. Quantitative analysis revealed that ethyl acetate fraction has the highest total phenolic content 42.15 mg GAEg whereas
hexane has the lowest 7.15 mg GAEg. The highest antioxidant activity measured by DPPH radical scavenging activity test was achieved by ethyl acetate
fraction with IC
50
value of 4.22 ppm, while the lowest was showed by hexane fraction with IC
50
value of 64.9 ppm. There was moderate correlation between total phenolic content and antioxidant capacity. The activity of anti breast cancer
MCF-7 cell proliferation on the other hand, achieved by hexane fraction with IC
50
value of 1.77 µgml and the lowest was showed by water fraction with IC
50
value of 136.74 µgml. There is no correlation between total phenolic content and anti
breast cancer MCF-7 cell proliferation Keywords: Plectranthus amboinicus Lour Spreng, phytochemical compounds,
antioxidant, anti proliferation, MCF-7
4.5 Pendahuluan
Secara umum khasiat yang dimiliki oleh bahan pangan bergantung pada komposisi bahan pangan tersebut. Plectranthus amboinicus Lour. Spreng
merupakan tanaman yang kaya akan nutrisi, yakni serat pangan tak terlarut 1,56, protein 0,6, serat pangan terlarut 0,31, mineral-mineral kalsium,
fosfor, kalium, natrium, magnesium, trace mineral zat besi, seng, tembaga, chromium, oksalat terlarut 0.02. Vitamin-vitamin asam askorbat, tiamin,
dan asam fitat Gupta et al. 2005.
Santosa dan Hertiani 2005 menganalisa secara kualitatif komponen dalam ekstrak air daun torbangun yang dapat meningkatkan kemampuan
fagositosis sel neutrofil. Hasil analisa menggunakan TLC thin layer chromatography menunjukan keberadaan senyawa polifenol, saponin, glikosida
flavonol dan minyak atsiri. Rout et al. 2010 melakukan uji kualitatif komponen torbangun yang berasal dari ekstraksi menggunakan berbagai pelarut yaitu air,
metanol, kloroform, dan petroleum eter. Analisa HPTLC memperlihatkan bahwa pada ekstrak air terdapat senyawa flavonoid, protein, asam amino, tannin, fenolik,
22
terpenoid, karbohidrat, glikosida dan alkaloid. Demikian pula pada ekstrak metanol yang memberikan hasil yang sama dengan ekstrak air. Sementara pada
ekstrak kloroform terdapat senyawa saponin, terpenoid dan steroid. Sedangkan pada ekstrak petroleum eter hanya terdapat senyawa saponin dan steroid.
Uji kualitatif juga dilakukan oleh Prameela dan Saj 2011 pada ekstrak metanol, kloroform dan petroleum eter. Hasil uji menunjukkan bahwa pada
ekstrak metanol terdapat steroid, terpenoid, tannin dan saponin. Pada ekstrak kloroform terdapat gula reduksi, flavonoid, terpenoid, tannin, coumarin dan
antraquinone. Sementara pada ekstrak petroleum eter mengandung steroid, coumarin dan saponin. Berdasarkan uji kuantitatif pada studi yang sama
menunjukkan bahwa torbangun mengandung total karbohidrat 2.8, total selulosa 1.7, total protein 9.36, total fenol 0.03 dan total tannin 0.68 mgg berat.
Studi oleh Bhatt dan Negi 2012 mengamati kandungan total fenol dari hasil ekstraksi berbagai jenis pelarut yaitu ekstraksi bertahap menggunakan
heksana, etil asetat, aseton dan metanol berdasarkan polaritasnya dibandingkan dengan ekstrak hidroalkohol dan bentuk kering beku. Hasil menunjukkan bahwa
total fenol tertinggi berasal dari ekstrak etil asetat ±59 kemudian ekstrak aseton ±52, ekstrak hidroalkohol ±33, bentuk kering beku ±25, ekstrak metanol
±23 dan ekstrak heksana ±11 mg GAEg ekstrak. Kandungan total fenol tersebut sejalan dengan kemampuan bioaktifitasnya dimana kemampuan
antioksidan tertinggi ditunjukkan oleh ekstrak etil asetat dan kemampuan antibakteri tertinggi oleh ekstrak aseton.
Hasil uji aktifitas antioksidan oleh Bhattacharjee 2010 menunjukkan bahwa ekstrak etanol yang berasal dari bagian daun tanaman torbangun memiliki
aktifitas antioksidan tertinggi dibandingkan bagian tanaman lainnya yakni batang dan akar. Hal ini disebabkan karena kandungan total fenolik, flavonoid, alkaloid
dan saponin juga lebih tinggi pada bagian daun dibandingkan batang dan akarnya. Dilaporkan bahwa pada ekstrak daun torbangun terdapat total fenolik 19,62 ±
0.83, flavonoid 4,21 ± 0.39, alkaloid 4,3 ± 0,74 dan saponin 2,09 ± 0,33 dalam persen beratberat. Namun seluruh bagian tanaman ini memperlihatkan
keberadaan komponen alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, triterpenoid, sedangkan karotenoid hanya terdapat pada daun dan batangnya.
Berdasarkan studi-studi tersebut terlihat potensi tanaman ini sebagai penyedia komponen bioaktif yang dapat dimanfaatkan untuk menusia. Studi ini
bertujuan mengetahui komponen fitokimia daun torbangun yang diekstrak menggunakan pelarut etanol dan difraksinasi dengan berbagai jenis pelarut yang
berbeda. Selain itu penelitian ini juga mengamati kapasitas antioksidan ekstrak dan fraksi yang dihasilkan serta menguji kemampuannya dalam menghambat
proliferasi sel kanker MCF-7. 4.6
Bahan dan Metode Penelitian Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2014 hingga Desember 2015 di Laboratorium SEAFAST CENTER South East Asian Food and
Agricultural Science and Technology Institut Pertanian Bogor, Laboratorium Mikrobiologi dan Immunologi Pusat Studi Satwa Primata Institut Pertanian
Bogor, dan Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB.
23
Bahan Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel tanaman
Torbangun yang diperoleh dari Kebun Percobaan IPB, Leuwikopo, Dramaga Bogor. Bahan untuk proses ekstraksi antara lain: pelarut etanol 97, n-heksana,
kloforom, etil asetat, aquades dan kertas saring. Sel yang digunakan adalah sel adenokarsinoma payudara galur MCF-7 yang disediakan oleh Laboratorium
Mikrobiologi dan Bioteknologi Pusat Studi Satwa Primata, IPB. Reagen-reagen dan
bahan untuk
kultur sel
seperti media
RPMI 1640,
FBS, penicillinstreptomycin, DMSO,
Dulbecco’s PBS, trypsin, dan trypane blue.
Peralatan penelitan
Peralatan untuk proses ekstraksi dan uji kimia yaitu freeze drier, sonikator, sentrifus, rotary evaporator, platform shaker, refrigerator, freezer, blender,
timbangan analitik, alat-alat gelas, vortex, vacuum filter, desikator, dan tabung sampel. Peralatan untuk kultur sel dan uji sitotoksisitas yaitu: incubator CO
2
, Biosafety cabinet Class 2, microscope fluorescence, hemocytometer, high speed
centrifuge, dan microplate reader.
Tahap persiapan sampel
Sampel daun torbangun Plectranthus amboinicus Lour. Spreng diekstrak dan difraksinasi sebagaimana prosedur yang telah dijelaskan pada Bab 3
terdahulu. Terdapat 5 fraksi yang akan diuji yakni ekstrak etanol, fraksi heksana, fraksi kloroform, fraksi etil asetat dan fraksi air.
Uji Fitokimia
Semua ekstrak dan fraksi diuji keberadaan komponen fitokimianya secara kuantitatif. Parameter uji fitokimia antara lain alkaloid, fenolik yang terdiri atas
flavonoid, tanin dan saponin, kemudian triterpenoid dan steroid serta hidrokuinon. Prosedur uji fitokimia tersaji dalam Lampiran 2.
Uji Kuantitatif Total Fenol
Total fenol ekstrak dan fraksi diukur dengan metode kolorimetri Folin- Ciocalteu Heydari Majd et al. 2014. Secara ringkas sampel dipersiapkan dengan
membuat larutan sampel dengan konsentrasi yang sesuai yakni sekitar 1000 ppm menggunakan etanol 80. Sebanyak 200 µl sampel ditambahkan pada 1 ml folin
10 dan 3 ml Na
2
CO
3
20. Larutan kemudian diaduk dengan vortex dan diinkubasi selama 2 jam dalam kondisi gelap. Absorbansi dibaca pada panjang
gelombang 760 nm. Absorbansi sampel dibandingkan dengan absorbansi standar asam galat. Total fenol diekspresikan sebagai miligram setara asam galat per gram
berat kering sampel.
Uji Aktifitas Antioksidan
Kemampuan antioksidan ekstrak dan fraksi dalam menangkap radikal bebas DPPH dianalisa dengan metode spektrofotometri berdasarkan Salazar-
Aranda et al. 2011. Ekstrak dilarutkan dalam etanol 1 mgml kemudian sampel ekstrak dengan 8 konsentrasi yang berbeda-beda dipersiapkan dengan
pengenceran bertingkat setiap jenis ekstrak dan fraksi memiliki kisaran
