Pembuatan Ekstrak n-heksana, Ekstrak Etilasetat dan Ekstrak Etanol Sterilisasi Alat dan Media Pembuatan Larutan Uji Ekstrak n-heksana, Etilasetat dan Etanol

3.5 Pembuatan Ekstrak n-heksana, Ekstrak Etilasetat dan Ekstrak Etanol

Secara Perkolasi Berkesinambungan Pembuatan ekstrak dilakukan secara perkolasi berkesinambungan menggunakan tiga pelarut. Cara kerja: sebanyak 400 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana tertutup, dituangi cairan penyari n-heksana sampai semua simplisia terendam sempurna dan dibiarkan sekurang-kurangnya selama 3 jam. Pindahkan massa sedikit demi sedikit ke dalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati-hati, dituangi cairan penyari secukupnya sampai cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, tutup perkolator dan biarkan selama 24 jam. Biarkan cairan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit, ditambahkan berulang-ulang cairan penyari secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Perkolasi dihentikan jika 500 mg perkolat yang keluar terakhir diuapkan, tidak meninggalkan sisa . Ampasnya di keringkan dan diperkolasi kembali dengan menggunakan cairan penyari etilasetat dengan prosedur perkolasi yang sama. Perkolat etilasetat di peroleh, ampasnya di perkolasi kembali dengan menggunakan cairan penyari etanol dengan menggunakan prosedur perkolasi yang sama. Masing-masing perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan alat penguap rotary evaporator dan dikering bekukan dengan freeze dryer Depkes, 1995.

3.6 Sterilisasi Alat dan Media

Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan didalam oven pada suhu 170°C selama 1 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Jarum ose dan pinset dengan lampu bunsen Lay,1994. 3.7 Pembuatan Media 3.7.1 Media nutrien agar NA Komposisi : Lab-Lemco beef extract 1.0 g Yeast extract 2.0 g Peptone 5.0 g NaCl 5.0 g Agar 15.0 g Distilled water 1.0 L Cara Pembuatan: Sebanyak 28 g sediaan NA ditimbang, disuspensikan kedalam air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut sempurna. Media dimasukkan kedalam erlenmeyer dan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit Oxoid , 2013.

3.7.2 Media Mueller Hinton agar MHA

Komposisi: Beef infusion form 300 g Casein hydrolysate 17,5 g Starch 1,5 g Agar 17 g Cara pembuatan: Sebanyak 38 g sediaan MHA ditimbang, disuspensikan kedalam air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut sempurna. Media dimasukkan kedalam erlenmeyer dan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit Difco, 1997.

3.7.3 Nutrien broth

Komposisi: Bacto beef extract 3,0 g Bacto peptone 5,0 g Cara pembuatan: Sebanyak 8 g nutrien broth dilarutkan dalam air suling steril sebanyak 1000 ml kemudian dipanaskan hingga semua larut, dalam keadaan panas larutan tersebut kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer. Disterilkan di autoklaf 121 C selama 15 menit Difco, 1997.

3.7.4 Pembuatan agar miring

Kedalam tabung reaksi dimasukkan 10 ml media Nutrien agar yang sudah dicairkan, kemudian diletakkan dengan posisi miring dengan kemiringan lebih kurang 45 o C, ditutup mulut tabung reaksi dengan kapas dan dibiarkan memadat. 3.8 Pembiakan Bakteri 3.8.1 Pembuatan stok kultur

3.8.1.1 Bakteri Escherichia coli

Biakan bakteri Escherichia coli dari strain utama diambil dengan jarum ose steril lalu diinokulasikan pada permukaan media nutrien agar miring, kemudian diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 24 jam. 3.8.1.2 Bakteri Staphylococcus aureus Biakan bakteri Staphylococcus aureus dari strain utama diambil dengan jarum ose steril lalu diinokulasikan pada permukaan media nutrien agar miring, kemudian diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 24 jam. 3.8.2 Penyiapan inokulum 3.8.2.1 Bakteri Escherichia coli Koloni bakteri Escherichia coli diambil dari stok kultur diambil menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan ke dalam 10 ml media nutrient broth steril lalu diinkubasikan pada suhu 37 o C sampai didapat kekeruhan dengan transmitan 25 menggunakan alat spektrofotometer UV panjang gelombang 580 nm Ditjen POM, 1995.

3.8.2.2 Bakteri Staphylococcus aureus

Koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dari stok kultur diambil menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan ke dalam 10 ml media nutrient broth steril lalu diinkubasikan pada 37 o C sampai didapat kekeruhan dengan transmitan 25 menggunakan alat spektrofotometer UV panjang gelombang 580 nm Ditjen POM, 1995.

3.9 Pembuatan Larutan Uji Ekstrak n-heksana, Etilasetat dan Etanol

Dengan Berbagai Konsentrasi. Sebanyak 5 g masing-masing ekstrak n-heksana, ekstrak etilasetat dan ekstrak etanol ditimbang seksama dengan neraca analitik, dilarutkan dalam 5 ml dimetil sulfoksida DMSO dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml. Tambahkan aquabidest steril hingga garis tanda dan diperoleh konsentrasi ekstrak 500 mgml. Larutan tersebut diencerkan kembali dengan dimetil sulfoksida DMSO dan aquabidest steril hingga didapat ekstrak dimetil sulfoksida DMSO dan aquabidest steril dengan konsentrasi 500 mgml, 400 mgml, 300 mgml, 200 mgml, 100 mgml, 90 mgml, 80 mgml, 70 mgml, 60 mgml,50 mgml, 40 mgml, 30 mgml, 20 mgml, 10 mgml.

3.10 Metode Pengujian Efek Antibakteri Secara In Vitro