4. Uji Kesesuaian Sistem
Larutan Medroksiprogesteron Asetat pada konsentrasi lebih kurang 10 gmL diinjeksikan sebanyak 20 L ke alat KCKT dengan fase gerak
terpilih, diulangi sebanyak enam kali. Kemudian dihitung jumlah lempeng teoritis, HETP Height Equivalent Theoritical Plate, faktor kapasitas,
asimetris, dan koefisien variasi ≤ 2.
5. Penetapan Metode Ekstraksi penentuan zat pengendap protein
plasma
Ke dalam tabung sentrifus dimasukkan 0,5 mL plasma yang sudah mengandung Medroksiprogesteron Asetat pada konsentrasi 5 gmL, lalu
ditambahkan dengan volume yang sama buffer potassium fosfat pH 7. Kemudian ditambahkan sebanyak 0,5 mL pentana, lalu dikocok dengan
vorteks selama 1 menit dan disentrifugasi pada 2000 rpm selama 20 menit. Diambil cairan supernatan kemudian diuapkan hingga diperoleh residu.
Ditambahkan fase gerak sebanyak 300 L. Hasil ekstraksi diinjeksikan sebanyak 20 L ke alat KCKT kemudian dicatat waktu retensi dan luas
puncaknya.
6. Validasi Metode Analisis Medroksiprogesteron Asetat Dalam Plasma
a. Pembuatan kurva kalibrasi dan uji linearitas dalam plasma in vitro Dibuat larutan blangko dan larutan Medroksiprogesteron Asetat
dalam plasma dengan konsentrasi 1 – 5 gmL, kemudian diekstraksi
sesuai prosedur. Lalu supernatan masing-masing sebanyak 20 L
disuntikkan ke alat KCKT pada kondisi terpilih. Setelah itu dianalisis regresi
perbandingan luas
puncak terhadap
konsentrasi Medroksiprogesteron Asetat dalam plasma dari masing-masing
konsentrasi dan dibuat kurva kalibrasi dengan persamaan garis regresi linier y = a + bx. Dihitung koefisien korelasi r dari kurva tersebut.
b. Limit deteksi LOD dan limit kuantitasi LOQ Larutan Medroksiprogesteron Asetat dalam plasma dengan
konsentrasi 1 – 5 gmL diekstraksi sesuai prosedur. Kemudian
supernatan sebanyak 20 L dari masing-masing larutan tersebut
disuntikkan ke alat KCKT pada kondisi terpilih. Setelah itu dianalisis regresi
perbandingan luas
puncak terhadap
konsentrasi Medroksiprogesteron Asetat dalam plasma dari masing-masing
konsentrasi dan dibuat kurva kalibrasinya. LOQ dihitung melalui persamaan garis regresi linier dari kurva
kalibrasi, dengan rumus : LOQ = 10 Syx
b sedangkan nilai batas deteksi LOD diperoleh dengan rumus :
LOD = 3 Syx b
Dimana Syx adalah simpangan baku residual, b adalah slope dari persamaan regresi.
c. Uji selektivitas Sebanyak 20
L sampel plasma yang telah diekstraksi dan mengandung medroksiprogesteron asetat pada konsentrasi 1
gmL disuntikkan ke dalam instrumen KCKT dengan kondisi fase gerak dan
kecepatan alir terpilih, diulang sebanyak 6 kali. Kemudian dihitung nilai koefisien variasinya KV dengan nilai
≤ 20 dan akurasinya diff
dengan nilai ≤ 20.
d. Uji akurasi Dibuat larutan Medroksiprogesteron Asetat dalam plasma dengan
konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi. Setelah itu diekstraksi sesuai prosedur. Supernatan seba
nyak 20 L disuntikkan ke alat KCKT dengan kondisi fase gerak dan kecepatan alir terpilih, diulangi
sebanyak tiga kali. Kemudian dihitung persentase akurasi diff dan perolehan kembali recovery dari masing-masing konsentrasi
larutan tersebut. Nilai rata-rata diff disyaratkan ≤ 15 dan ≤ 20
untuk konsentrasi rendah. Sedangkan nilai perolehan kembali dihitung dengan cara membandingkan konsentrasi medroksiprogesteron asetat
dalam plasma yang diperoleh dari hasil ekstraksi dengan konsentrasi medroksiprogesteron asetat yang sebenarnya dikalikan dengan 100.
Perolehan kembali disyaratkan pada rentang 98 –102 untuk sediaan
farmasi dan jika dalam sampel biologis menjadi ± 10 dari persyaratan tersebut.
e. Uji presisi Dibuat larutan Medroksiprogesteron Asetat dalam plasma dengan
konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi. Setelah itu diekstraksi sesuai prosedur. Supernatan sebanyak
20 L disuntikkan ke alat KCKT dengan kondisi fase gerak dan kecepatan alir terpilih, diulangi
sebanyak tiga kali. Dilakukan pengukuran intra-hari dan inter-hari selama 2 hari berturut-turut, kemudian dihitung nilai simpangan baku
relatif atau koefisien variasi KV dari masing-masing konsentrasi dengan nilai ≤ 15 dan untuk konsentrasi rendah ≤ 20.
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Percobaan 1. Penentuan Metode Analisis Dalam Plasma
Kategori